(忻州师范学院化学系,山西忻州 034000)

毛建草(DracocephalumrupestreHance)是一种唇形科青兰属草本植物[1]。其株高约15～42 cm,全草具有香味,可做茶饮,因而又俗称“毛尖”[2]。除了作为地方茶在本地供饮用外,它本身还具有很高的药用价值。研究发现,毛建草属植物具有抗氧化、防治心血管疾病、抗衰老、防肿瘤、供氧[3-7]等多种功能,因而对毛建草的研究有利于对其开发利用。

目前,有很多关于毛建草的研究成果。李慧卿等[8]发现毛建草含有丰富的、具有较强抗氧化性作用的茶多酚;任冬梅等[9]、欧阳丹薇[10]用气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱法对毛建草有效成分进行了分离和鉴定,发现了多种黄酮类物质;郑晓敏等[11]测定出了毛建草叶中含有的多种人体微量元素。Zhu等[12]报道毛建草提取物对实验小鼠肝损伤有保护作用,Jing等[13]研究发现毛建草提取物对Aβ25-35肽氧化有一定的抑制作用,也有一些研究者探究了毛建草糖苷提取物药用机理[14-15]。但是关于赋予毛建草芳香气味的物质研究报道较少。而植物的香味组分,多是由于其具有挥发性的“精油”[16]。它除了能带给人感官愉悦之外,还具有增香、杀菌、抗病毒和抗氧化等生物活性,在香料、化妆品、食品工业、制药、医疗及农业虫害防治等方面都有广泛应用[17-19],享有“液体黄金”之佳誉。而毛建草精油的相关研究较少。

本文采用传统的溶剂浸提和水蒸气蒸馏方法分别得到精油产品[20-21],进而研究来源于不同方法的产品对DPPH·的清除作用以及其抗氧化动力学,以求为进一步利用不同的毛建草精油产品,以及其抗氧化性开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛建草 购于忻州市宁武县管涔山农户,为其头年采摘自然晾干干品,包括杆、叶等全草;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 英国Alfa Aesar公司;芦丁 分析纯,国药集团。

UV-2550紫外可见分光光度计 日本岛津公司;CF-B电热恒温水浴锅 河北晟兴仪器;80-2B电动离心机 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 毛建草精油的提取

1.2.1.1 水蒸气蒸馏法 称取10 g毛建草粉末于圆底烧瓶中,按料液比1∶6 (g/mL)加入4%的NaCl溶液,浸泡2 h后水蒸气蒸馏,保持微沸2 h,收集馏分,得到精油溶液。用适量石油醚萃取所得精油溶液,萃取三次后弃去水相,收集萃取液,在30 ℃下旋蒸除去石油醚,得到精油产品[22],重复3次,合并产品,得其提取率为1.70‰。

1.2.1.2 溶剂浸提法 称取10 g毛建草粉末于圆底烧瓶中,按照液料比6∶1加入石油醚,密封浸泡2 h后进行回流操作,保持微沸反应2 h,冷却后抽滤,收集滤液,离心后收集上清液,得到精油溶液。在30 ℃下旋蒸除去石油醚,得到精油产品,重复3次,合并产品,得其提取率为4.54‰。

1.2.2 DPPH·清除率测定 称取0.0079 g的DPPH·于烧杯中,用无水乙醇溶解,将溶液转移到100 mL容量瓶中,定容,配制成2×10-4mol·L-1的溶液,低温避光保存。

将水蒸气蒸馏、溶剂浸提法得到的毛建草精油,用无水乙醇稀释成体积比为1∶10的两组样品液。每组再分别取样品液0、100、200、300、400、500 μL于6支比色皿中,然后加入无水乙醇及1 mL 2×10-4mol·L-1的DPPH·溶液,使总体积为2 mL,从而分别得到体积分数为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5% 的精油溶液,混匀,避光放置30 min,在517 nm处吸光度[23]。DPPH·清除率计算公式为:

式中,A:加入毛建草精油时DPPH·溶液的吸光度;A0:毛建草精油在测定波长处的吸光度;A1:未加入毛建草精油时DPPH·溶液的吸光度。

1.2.3 抗氧化动力学研究

1.2.3.1 精油初始浓度对清除DPPH·动力学的影响 在精油初始浓度对清除DPPH·动力学的影响实验中,按实验1.2.2方法,取精油体积分数分别为0.5%、1%、1.5%等3个样品与DPPH·迅速混匀,检测其517 nm处吸光度随时间变化。

1.2.3.2 温度对清除DPPH·动力学的影响 在温度对精油清除DPPH·动力学的影响实验中,精油样品取体积分数为1.5%,分别于30、37、45 ℃下检测。温度通过样品池与水浴锅连通,预先设置到所需要温度。

1.2.4 毛建草蒸馏精油与芦丁共存时对DPPH·的清除作用 量取一定体积的蒸馏精油稀释样品液于烧杯,称重;然后量取相同体积的乙醇,加入固体芦丁,使总质量与精油溶液相等,得芦丁溶液浓度为0.04 mg·mL-1。配制芦丁、毛建草蒸馏精油1∶1混合溶液。

芦丁样品液分别取1、2、3、4、5 mL,操作同1.2.2。蒸馏精油以及两者混合液同芦丁操作,测定其对DPPH·的清除率。

1.3 数据处理

实验记录数据用Excel 2013处理,由Origin 8.6 作图形文件。拟合直线及拟合参数都用Origin 8.6软件生成。

2 结果与分析

2.1 毛建草精油对DPPH·的清除率

采用水蒸气蒸馏、溶剂浸提法两种方法得到的毛建草精油产品对DPPH·的清除率结果如图1所示。

图1 不同方法提取的毛建草精油对DPPH·的清除率Fig.1 DPPH· scavening rate of essential oils extractedfrom Dracocephalum rupestre Hance by different methods

两种方法得到的毛建草精油都对DPPH·有明显的清除效果,并且是随着浓度的增加清除率增加。同等浓度下,浸提精油产品对DPPH的清除率远远大于蒸馏精油,但随着浓度的增加,清除率增加较缓慢;而水蒸气蒸馏精油产品,虽然起始清除率相对较小,但随着浓度增加,清除率逐渐增大,两者之间的清除率差异逐渐减小。在精油体积分数为2.5% 时,浸提精油清除率达到81.56%,而蒸馏精油为57.78%。即浸提精油产品的自由基清除能力相对更强,在低浓度时就有很高的活性,而馏出精油需要较大的浓度才能实现对自由基的清除作用。

毛建草对自由基有较强的清除作用,是由于其含有多酚、黄酮类、多糖等多种抗氧化成分[3]。除了多糖类不易溶于有机溶剂,在浸提产品中易被过滤除去之外,仍有多酚、黄酮类等其他组分残留在溶剂中,因而毛建草浸提液有较强的清除自由基能力。而蒸馏馏分主要为毛建草挥发性香味组分,组成相对单一。尽管该组分清除自由基能力弱于浸提液,实验显示仍有较强的自由基清除能力。

2.2 毛建精油的抗氧化动力学研究

2.2.1 毛建溶剂浸提精油清除DPPH·动力学

2.2.1.1 溶剂浸提精油初始浓度对清除DPPH·动力学的影响 分别取不同初始浓度的精油提取液,检测其对DPPH·的清除作用,结果见图2。不同初始浓度下,精油清除自由基的动力学基本相似。首先,清除能力随时间近乎线性增强,而后清除能力逐渐减缓,最后达到平衡,与许多抗氧化剂对自由基的清除动力学曲线相似[24-25]。比较不同浓度下,精油对自由基的清除动力学可以发现,随着浓度的增大,清除反应速率明显加快:当加入精油体积分数为0.5%时,反应25 min才达到平衡;当精油初始浓度体积分数达1.5%时,约20 min反应就达到了平衡。随着提取液初始浓度增大,到达平衡时DPPH·自由基清除率增大。

图2 不同初始浓度浸提精油清除DPPH·动力学Fig.2 DPPH· scavening kinetics of essential oilby solvent extraction with different initial concentrations

2.2.1.2 温度对溶剂浸提精油清除DPPH·动力学的影响 为了识别毛建草浸提精油对DPPH·自由基清除能力是否受温度的影响,精油在不同温度下清除自由基的动力学相比较。图3是浸提精油初始浓度均为1.5% 时,分别在30、37、45 ℃下清除DPPH·的动力学曲线。在实验温度范围内,DPPH·清除曲线特征基本没有发生改变,只是随着温度升高,到达平衡时时间缩短,平衡时浸提精油产品的自由基清除率提高,与文献[26]结果一致。升高温度,反应速率加快,清除反应较快达到平衡,清除率也有所提高。

图3 不同温度下浸提精油清除DPPH·动力学Fig.3 DPPH· scavening kinetics of essential oilby solvent extraction with different temperatures

2.2.2 毛建草蒸馏精油清除DPPH·动力学

2.2.2.1 蒸馏精油初始浓度对清除DPPH·动力学的影响 室温下,分别取不同量的馏出精油,检测其对DPPH·的清除作用,结果见图4。相同时间下,不同初始浓度馏出精油对自由基的清除能力,随着浓度的增大而增强。

图4 不同初始浓度馏出精油清除DPPH·动力学Fig.4 DPPH· scavening kinetics of distillate essential oilwith different initial concentrations

2.2.2.2 温度对毛建草馏出精油清除DPPH·动力学的影响 在温度30、37、45 ℃范围内,毛建草馏出精油清除DPPH·动力学曲线基本相似,如图5所示。随着时间的延长,清除DPPH·先快后慢,后逐渐趋缓,最后实现平衡。

图5 不同温度下馏出精油清除DPPH·动力学Fig.5 DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil with different temperatures

2.3 毛建精油抗氧化动力学参数的分析

根据已有的数学模型,将实验测得的数据进行相应的拟合,可近似推断DPPH·自由基清除的动力学过程。零级反应描述的是反应速率不依赖于反应物浓度改变而变化,以自由基残存百分率对时间做图(100-K)-t,应为线性;一级、二级反应动力学分别表现为ln(100-K)-t、1/(100-K)-t为线性。

2.3.1 毛建草溶剂浸提精油清除DPPH·动力学参数 根据不同动力学模型,把30 ℃下清除率随时间的变化曲线进行拟合,拟合结果见表1。比较不同模型的决定系数可以看出,溶剂浸提精油清除DPPH·的动力学过程更符合二级反应模型(R2=0.9543)。

表1 溶剂浸提精油清除DPPH动力学拟合方程Table 1 Fitting equation of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction

把不同温度下的动力学曲线,根据二级反应进行拟合,结果如图6,由相应的截距及斜率可以求出对应温度下该反应的速率常数k(表2)。以lnk对温度的倒数1/T作图,根据Arrhenius(lnk=lnA-Ea/RT),直线的截距为lnA,斜率为-Ea/R,由此计算反应的活化能Ea(kJ·mol-1)、阿累尼乌斯常数A(表2)。

图6 不同温度下浸提精油清除DPPH·二级反应动力学拟合曲线Fig.6 Fitting lines of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction accordingto second-order reaction at different temperatures

由表2可知,毛建草浸提精油与DPPH·的反应中,反应的速率常数k随温度T的升高而增加,但变化幅度都比较小,由于反应活化能Ea,以及常数A比较小,因此反应温度对该反应速率影响不大。

表2 不同温度下浸提精油清除DPPH·二级反应动力学拟合参数Table 2 Fitting parameters of DPPH· scavening kinetics ofessential oil by solvent extraction accordingto second-order reaction at different temperatures

2.3.2 毛建草蒸馏精油清除DPPH·动力学参数 毛建草馏出精油对DPPH·清除率动力学根据不同反应级数拟合结果见表3。比较其决定系数,可以看出反应更趋向于二级反应模型(R2=0.9522)。

表3 馏出精油清除DPPH·动力学拟合方程Table 3 Fitting equation of DPPH·scavening kinetics of distillate essential oil

把不同温度下的动力学曲线,根据二级反应进行拟合,结果如图7,由相应的截距及斜率可以求出对应温度下该反应的速率常数k(表4)。以lnk对温度的倒数1/T作图,计算反应的活化能Ea、阿累尼乌斯常数A(见表4)。

图7 不同温度下馏出精油清除DPPH·二级反应动力学拟合曲线Fig.7 Fitting lines of DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil according to second-orderreaction with different temperatures

表4 不同温度下毛建草馏出精油清除DPPH·二级反应动力学拟合参数Table 4 Fitting parameters of DPPH· scavening kinetics ofdistillate essential oil according to second-orderreaction with different temperatures

由表4可知,毛建草精油与DPPH·的反应中,反应的速率常数k随温度T的升高而增加。与毛建草浸提精油相比,馏出精油对自由基的清除反应活化能Ea、以及常数阿累尼乌斯常数A稍大,反应温度对该反应速率常数k影响要比溶剂浸提精油大。

2.4 毛建草馏出精油与芦丁共存时对DPPH·的清除作用

加入同体积精油,溶剂浸提法得到的产品清除DPPH·的能力明显高于水蒸气蒸馏产品。除了两种精油产品组分、含量有相对差异外,组分间的协同作用也是一个可能的因素。由于毛建草含有较多的黄酮类成分[8],溶剂浸提精油比蒸馏精油不可避免地会额外多引入该类物质(黄酮类物质中沸点较高的物质不容易经蒸馏馏出,而由于其芳环的脂溶性,会溶于有机浸提溶剂中),多出的黄酮组分对清除自由基会有贡献,当精油与这些黄酮存在协同作用时,会进一步提高对自由基的清除率。为了探讨毛建草馏出精油与草中黄酮类组分是否存在协同作用,为其适配做理论基础,以芦丁为黄酮替代品,继续研究了毛建草蒸馏精油与其共存时对DPPH·的清除作用。

图8是反应45 min时,不同浓度的芦丁、毛建草馏出精油、毛建草馏出精油与芦丁1∶1的混合溶液对DPPH·的清除率。相同浓度的芦丁与馏出精油相比,芦丁对DPPH·的清除率明显优于毛建草馏出精油。芦丁在低浓度时其对DPPH·的清除率随浓度几乎呈线性变化,但随着浓度加大清除率逐渐趋于平缓;毛建草馏出精油对DPPH·的清除率在实验范围内呈现近乎线性的增长趋势,但清除能力远低于芦丁;而混合溶液对DPPH·的清除率同浓度下只略高于毛建草馏出精油。如果毛建草馏出精油与芦丁各自独立执行清除自由基功能,在各自线性范围内,其混合溶液对DPPH·的清除率应为其拟合虚线(各组分1/2浓度时清除率的和)。而实际混合溶液的DPPH·清除曲线,与之相比明显偏低。这意味着毛建草馏出精油在与芦丁共存下,清除DPPH·能力受到抑制,二者之间不仅没有协同作用,还存在拮抗作用。

图8 馏出精油、芦丁及两者1∶1混合液对DPPH·的清除率Fig.8 DPPH· scavening rates of distillateessential oil,rutin and their mixture(1∶1)

分别对其DPPH·清除曲线线性部分进行拟合,求其IC50,结果如表5,IC50(芦丁)

表5 馏出精油、芦丁的DPPH·清除反应的IC50值Table 5 IC50values of distillate essential oil,rutinand their mixture(1∶1)for DPPH· scavening reaction

有文献报道,协同抗氧化主要是由于抗氧化组分间相互发生作用形成复合物,因而对自由基(或其他氧化组分)清除作用增强[27-28]。经气相色谱检测,毛建草的主要挥发性组分为酯类、芳香醛类、酮及酚类、芳香醇类,它们可提供一些活性基团与芦丁发生作用(或形成pi-pi作用),从而可能影响到了自身对DPPH·的清除效力,使总体效力下降。产生抗氧化协同作用的原因,在毛建草精油与芦丁间可能也正是使其产生拮抗的原因。只是溶剂浸提液中组分较为复杂,实验中仅仅以芦丁作为黄酮替代,并不能完全反映溶液中的真实状况,可能多种组分间同时存在着协同和拮抗,最终体现出来的只是综合效应。这些有待进一步探索。

3 结论

溶剂浸提毛建草精油与蒸馏得到的毛建草精油都具有抗氧化性,在精油体积分数为2.5% 时,浸提精油的清除率达到81.56%,而蒸馏精油为57.78%,相同体积浓度下溶剂浸提产品抗氧化性更强;在实验条件下,两者清除DPPH·自由基的动力学曲线更接近二级反应,提高浓度与温度都可加速其反应;毛建草蒸馏精油与芦丁清除DPPH·的IC50值依次为0.034、0.006 mg/mL,而其1∶1混合物为0.012 mg/mL,明显高于二者的拟合值0.009 mg/mL,说明蒸馏得到的毛建草精油与黄酮类物质芦丁,不存在协同作用,反而存在拮抗作用。本研究为更好地利用和开发不同的精油产品提供了借鉴与思路。