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(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 2.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023)

脂肪酶(E.3.1.1.3)能够催化甘油三酯水解成为甘油二酯、甘油一酯或甘油和游离脂肪酸。20世纪90年代后,人们探索并发现了脂肪酶在烘焙食品中的功能和应用价值。脂肪酶能够增大面包体积、改善面包组织结构、增白面包芯等,且作为一种天然、“绿色”的生物制品,应用于面包中不会产生对人体有毒有害的物质。双乙酰酒石酸单(双)甘油酯(Diacetyl Tartaric Acid Ester Of Mono(Di)Glycerides,DATEM)虽然是一种广泛使用的面包改良剂[1],但可检测到化学物质的残留[2]。在面包中的用量方面,由于脂肪酶的催化效率非常高,其用量仅为化学改良剂的1/500,大大降低了生产、运输、储存和使用成本[3]。

寻求烘焙可用的脂肪酶是目前的研究热点。自然界中脂肪酶来源广泛,微生物产生的胞外脂肪酶更具有开发和商业利用价值。张峦等[4]利用基因工程获得的新型重组华根霉脂肪酶能显著改善面包的烘焙品质。Paciello等[5]发现枯草芽孢杆菌脂肪酶A可增强面包风味。不同微生物来源的脂肪酶具有不同特性,在面包体系中发挥的功效也不同。疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase,TLL)是一种高活性、高稳定性及Sn-1,3位专一性的酶,在55～60 ℃可维持稳定酶活[6]。长期以来TLL得到了广泛的关注与研究,主要是利用固定化方法进一步提高酶的利用率及稳定性,拓展其应用范围,TLL的应用最早是面向食品工业,现在还用于生物柴油、对映体选择等领域[7],而TLL在面包体系中的应用目前鲜有报道。仅有Castello等[8]报道Sn-1,3位专一性脂肪酶能够改善面粉的脂质组成。本实验室通过基因工程优化TLL基因(序列GenBank登录号AF054513.1),经EcoR I/Not I双酶切连接至表达载体pPIC9K的多克隆位点中,并将表达载体以同源重组的方式整合到毕赤酵母原始宿主菌GS115基因组中,实现了重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(RecombinantThermomyceslanuginosusLipase Produced byPichiapastoris,PTL)的高效表达,pNPP法测得高密度发酵后酶活可达24522.6 U/mL[9]。因此,PTL不仅能在各种条件下稳定发挥作用,还具有性价比高的优势。

本研究基于脂肪酶对面包的三大主要作用,即增大面包比容、增白面包芯和改善组织结构,探究PTL的最佳使用量范围,并阐明了不同用量脂肪酶对面包的影响。后分别取PTL、商业脂肪酶Lipopan F BG(以下简称FBG)以及DATEM推荐用量的中间值应用于面包体系,从面包比容、质构、感官评定等方面分析不同添加剂的作用特点,并采用扫描电镜和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(Head-Space Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometer,HS-SPME-GC-MS)分别对面筋网络结构及面包芯风味物质进行分析,为PTL在面包烘焙工业中的应用提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FBG 诺维信公司;高筋小麦面粉(不含任何食品添加剂) 河北金沙河面业公司;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;DATEM 郑州裕和食品添加剂公司;黄油、食盐、白砂糖等 市售;PTL 本实验室制备;锇酸 SPI-CHEM公司;戊二醛、PBS缓冲液、乙醇 国药集团化学试剂公司。

和面机 广东小熊电器有限公司;PRX-150B智能培养箱 宁波赛福实验仪器有限公司;SEC-2Y电烤炉 江苏三麦食品机械有限公司;TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司;ColorFlex EX CFEZ2316色差仪 美国HunterLab公司;GeminiSEM 300扫描电镜 德国ZEISS公司;HCP-2型临界点干燥仪 Hitachi公司;57328-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司;7890B/5977A气质联用仪 安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 面包的配方及制备 面包基础配方:高筋小麦粉100%,活性干酵母1%,蔗糖6.7%,食盐1%,黄油5%,水60%(均以小麦面粉质量计)。未添加脂肪酶及DATEM的样品为对照组。分别加入10、20、30、40 mg/kg PTL以研究面包中PTL的最佳用量。FBG的推荐用量为10～20 mg/kg[2],GB 2760-2014规定DATEM在焙烤食品中的用量不超过20 g/kg[10],取中间值,即PTL组和FBG组分别加入相应的脂肪酶15 mg/kg,DATEM用量为10 g/kg,以比较不同添加剂的使用效果。

面包制作工艺:干料混匀后加入水和黄油搅拌,搓圆整形,静置(25 ℃,10 min),装入模具(170 mm×80 mm×80 mm),醒发1 h(38 ℃、相对湿度为85%),烘烤30 min(上火180 ℃、下火220 ℃),得到成品面包,室温冷却1.5 h后用于分析测定。

1.2.2 面包比容测定 面包称重,体积采用菜籽置换法测定。面包比容计算公式如下:

1.2.3 面包组织结构分析 取面包中心厚度为20 mm的切片(如图1所示),使用NikonD7000数码相机采集照片并用Image J软件进行图像分析。

图1 面包切片取样示意图Fig.1 Schematic diagram of bread slice sampling

1.2.4 面包芯白度测定 取面包中心厚度为20 mm的切片。选择L*a*b*色度标尺,测量L*值,该值表示面包芯白度,在0～100范围内变化,0表示黑色,100表示白色。

1.2.5 扫描电镜样品制备 搅拌得到的面团样品在2.5%的戊二醛溶液中固定12 h以上,用0.1 mmol/L PBS缓冲液漂洗,然后用1%的锇酸溶液固定,再用0.1 mmol/L PBS缓冲液漂洗,最后用梯度浓度的乙醇溶液进行脱水处理。临界点干燥后喷金镀膜,置于扫描电镜下观察[11]。

1.2.6 面包质构测定 取面包中心厚度为20 mm的切片测定。参数设定为:测前速度2.0 mm/s,测试速度1.0 mm/s,测后速度1.0 mm/s,压缩比为50%,P5型探头。

1.2.7 面包芯风味物质分析 采用HS-SPME-GC-MS联用技术[12]。准确称取面包芯1.5 g,切碎,60 ℃顶空固相微萃取40 min。色谱柱:J&WHP-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);升温程序:40 ℃保持1 min,以6 ℃/min的速度升至160 ℃,最后以10 ℃/min的速度升至250 ℃,保持10 min;载气(He)流量:1 mL/min;进样温度为250 ℃;进样量1 μL;不分流。挥发性风味物质化合物的定性及相对定量分析:GC-MS结果经计算机NIST Library相匹配,定性检索图谱峰,采用面积归一化法计算相对百分含量。

1.2.8 感官评定 随机选取28名不同年龄阶段(20～40岁)、不同民族、未经过专业感官评定训练的人员通过九点嗜好法[13]对4组面包(对照组、PTL组、FBG组、DATEM组)进行感官评定,评判内容包括面包外观、内部组织结构、酸度、气味、味道、口感和整体接受度,评分细则见表1。

表1 九点嗜好法感官评分细则Table 1 Nine-point hedonic scalefor sensor evaluation of bread crumb

1.3 数据处理

试验数据均以重复试验的平均值±标准差(Means±SD)表示。使用SPSS 22.0软件和Graphpad Prism 8.0.2软件进行统计分析和绘图。各组之间差异比较采用One-way ANOVA中的Tukey多重比较法检验显著性,P<0.05判断为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PTL对面包比容的影响

由图2可知,PTL添加量为10和20 mg/kg时,面包比容显著高于对照组(P<0.05),分别增加了10.1%和10.8%。面包体积与面筋网络强度、持气性等有关。Poulsen等[14-15]指出,脂肪酶水解甘油三酯产物单/双甘油酯是良好的乳化剂,能与谷蛋白更好地结合并加强对面筋网络的桥架作用。魏巍[16]发现脂肪酶添加量为15～25 mg/kg时面包比容较大。本试验中随着PTL用量增加(>20 mg/kg),面包比容呈下降趋势。这与Si等[17]的观点相一致,过量脂肪酶会造成面包体积增加量的减少。有学者认为这与脂肪酶广泛的水解作用有关[18]。水解产生过量脂肪酸对面团体系具有负面影响,面团筋力过强抑制了面团发酵过程的体积膨大[18]。另外,Gerits等[20]认为脂肪酶过量导致气孔发生部分合并,在不断增大的压力下面包的体积膨大提前终止。综上,适量的PTL能显著改善面包的比容特性(P<0.05),10～20 mg/kg为最佳添加量。

图2 PTL用量对面包比容的影响Fig.2 Effect of PTL addition on specific volume of bread注:不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05);图4同。

2.2 PTL对面包组织结构的影响

组织结构决定了面包的口感,可间接反映面包的持气率和稳定性,与面包体系中面筋网络强度有关。烘焙阶段温度达到60 ℃时淀粉发生糊化并硬化,面团由半固体泡沫状转化为固体海绵状,多孔结构形成。一般地,面包芯中气孔分布均匀、气孔面积占比大,说明面包组织结构佳。

由图3可知,未添加PTL的面包中尺寸大的气孔较多,气孔壁较厚,组织结构较粗糙。加入PTL后面包单位面积气孔增多,且用量为30 mg/kg时气孔密度显著大于对照组(P<0.05)(见表2)。气孔面积占比随PTL用量的增加,呈现先增大后减小的趋势。王雨生等[19]也发现添加脂肪酶能使面包内部结构更细腻,网孔大小一致且尺寸较小。王学东等[21]发现20 mg/kg脂肪酶改善面包内部组织结构效果最好。脂肪酶用量过多会造成面筋强度过大,气孔面积减小。因此,PTL用量为10～20 mg/kg时,面包组织结构较佳。

表2 PTL添加量对气孔结构的影响Table 2 Effect of PTL addition on structure of gas cell

表4 不同添加剂对面包质构的影响Table 4 Effect of different additives on bread texture

图3 PTL用量对面包组织结构的影响Fig.3 Effect of PTL addition on crumb texture注:A～E分别代表PTL用量为0(对照组)、10、20、30、40 mg/kg。

2.3 PTL用量对面包芯白度的影响

脂肪酶对面包芯的增白作用可通过多种途径实现:一是水解脂质使其中的色素溶出同时释放脂肪酸,脂肪酸在脂肪氧化酶的作用下产生过氧化物进一步氧化色素(如胡萝卜素等),从而达到二次增白效果[22]。二是通过改善面包芯的组织结构,使之更加细腻、均匀而实现视觉上的增白[23]。有报道称,面包芯白度与组织结构(影响光反射)有关[24]。尽管PTL能够显著改善面包组织,用量为30 mg/kg时气孔密度最大,气孔面积占比较大(见2.2),对应的L*值也较大。然而,脂质氧化程度受原料本身及其混合条件等多种因素的影响[25-27]。表3中,不同PTL用量的面包芯L*值与对照组无显著差异(P>0.05),可能是面粉中脂肪氧化酶的活力水平较低导致脂肪酶的增白效果不显著,李守宏等[23]也有此发现。

表3 PTL用量对面包芯白度的影响Table 3 Effect of PTL addition on crumb luminosity

2.4 不同添加剂对面包比容的影响

上述试验明确了PTL的最佳用量范围为10～20 mg/kg。进一步研究比较PTL、FBG和DATEM对面包品质的影响并评价PTL的使用效果。

如图4所示,PTL和FBG均显著提高了面包比容(P<0.05),较对照组分别增加了9.8%和11.9%。脂肪酶的作用效果取决于其对脂质的水解程度及水解产物组成。De Maria等[28]认为,最“完美”的脂肪酶应该对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂这三种底物都具有适当的活性。然而,目前还不清楚何种脂肪酶可被称为最“完美”的以及每类脂质该水解到何种程度。Gerits等[18]用不同特异性的脂肪酶改变小麦内源性脂类的组成,发现面包体积的增加与半乳糖脂和磷脂含量的降低有关。相应地,Chung等[29]也发现面包比容与极性组分的含量呈显著正相关。至今,烘焙行业已经历了三代商品脂肪酶[2,30],FBG属于第二代,其优势是对极性和非极性脂类均有水解作用能产生更多极性组分,包括溶血卵磷脂和单半乳糖甘油二酯,因此FBG对面包比容的提高效果优于PTL。

图4 不同添加剂对面包比容的影响Fig.4 Effect of different additives on specific volume of bread

本试验中,DATEM对面包比容无显著增大作用(P>0.05)。有学者认为,由脂肪酶产生的“表面活性剂”与直链淀粉形成复合物的亲和力高于DATEM[31-33]。此外,DATEM是一种复杂的混合物,DATEM的作用随其组成成分的不同而改变,且对于蛋白含量不同的面粉作用效果不同[34-35]。张峦等[36]在面包中添加0.5%DATEM使得其比容显著增加。而Gerits等[20]认为DATEM对面包体积的影响不具有剂量依赖性。

2.5 不同添加剂对面团微观结构的影响

原料混合阶段,面粉中的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白通过二硫键与氢键相互作用形成面筋网络,淀粉颗粒镶嵌在该结构中,同时空气混入面团体系中形成一个个气孔。有报道称,面团发酵阶段不会形成新的气孔,酵母产生的CO2只能扩散并填充到现存的气孔中,因此面筋网络及气孔的形成对于面包组织结构非常重要[3,37]。在原料混合阶段,面筋网络是负责稳定气孔、保证持气性的主要(甚至是唯一)因素[18]。

由图5可以看出,对照组面团扫描电镜(SEM)图中有较多大小不一的淀粉颗粒暴露在外,没有形成连续的面筋网络,还可看到断裂的、成片状的面筋膜。PTL组和FBG组均有大范围的面筋束出现,淀粉颗粒镶嵌在其中,且FBG组的面筋网络中还包括了小范围的丝状连接,纵横交错地将淀粉颗粒串联起来,结构更为细腻、有韧性,这可能与FBG水解生成更多的极性脂类有关。有研究称,面筋网络中超过一半的淀粉颗粒与极性脂类相结合[38],极性脂质能通过降低蛋白聚合物的静电斥力而提高聚合力,增强面筋网络并间接稳定气孔结构。DATEM组面团中没有出现大范围的丝状面筋网络,但与对照组相比淀粉颗粒更紧密地团簇在一起,也没有断裂的面筋膜出现。有报道称,脂肪酶水解产物与DATEM作为乳化剂的作用机制存在一定差异:DATEM在原料混合阶段直接改变脂质组成,且与其他外源性脂质相互竞争和谷蛋白作用[39]。而脂肪酶水解脂类是一个过程[20],更有利于面筋反应的动态平衡和有序排列[40]。因此,从面筋的扫描电镜结果来看,FBG增强面筋网络的效果最好,PTL次之,DATEM稍胜于对照组,且上述结果直接反映在面包比容特性上(图2,图4)。

图5 不同添加剂对面团微观结构的影响(600×)Fig.5 Microstructure of doughs in thepresence of different additives(600×)注:A～D分别为对照组、PTL组、FBG组、DATEM组。

2.6 不同添加剂对面包质构的影响

面包质构是直接反映面包品质的重要指标之一。硬度与面包品质呈负相关[41]。如表4所示,脂肪酶PTL和FBG能使面包硬度显著降低(P<0.05)。当形成直链淀粉-脂质复合物时,表面活性剂能有效防止面包变硬[42]。脂肪酶水解甘油三酯产生的小分子产物与淀粉结合,有效阻止了淀粉分子的重结晶[3]。胶着性、咀嚼性与面包品质呈负相关,三种添加剂都有改善效果,其中FBG组面包口感最好。内聚性和回复性与面包品质呈正相关[42],PTL对这两个指标改善最大,但可能受烘焙因素的影响,一定程度上掩盖了其使用效果。综上,PTL能够显著降低面包硬度(P<0.05),仅次于FBG,还能对内聚性和回复性有一定程度的改善。

2.7 面包芯风味物质分析

面包芯的风味物质中乙醇所占比例最大,与许多研究结果一致[43-44],从高到低依次为PTL组(57.7%)、DATEM组(37.9%)、对照组(28.4%)、FBG组(25.0%)。酯类物质化合物大部分表现为果香及花香[45],对面包香气有较大的贡献。加入脂肪酶(PTL及FBG)后,面包的呈香成分明显增多,FBG组酯类含量明显高于其余三组。Paciello等[5]发现枯草芽孢杆菌脂肪酶A能增强面包总体香气。对照组、PTL组、FBG组、DATEM组面包芯中分别检出酯类物质1、1、5、2种,烃类物质9、10、12、5种。据报道,烃类物质芳香阈值较高,但其中有些是产生杂环化合物的重要中间体,有利于提升面包的整体香气[46]。关于酸类物质,只有DATEM组中检测到了乙酸存在,且含量较高为25%。醛酮类和杂芳环类的含量及香气阈值较低,对面包香气有较大影响,在各组面包芯中成分差异较大。其中,正己醛在对照组中含量最高,与Pico等[47]研究一致,被认为是脂质氧化产生;2-戊基呋喃具有豆香、泥土香及类似蔬菜的香味[47],FBG组中没有检出。面包芯的整体香味是复杂的风味物质综合作用的结果,进一步通过感官评定分析评估。综上,加入脂肪酶PTL能够增加风味物质的种类及相对含量。

图6 面包芯的风味物质Fig.6 Flavor compounds in bread crumb

2.8 感官评定

九点嗜好法产生的感官评定得分反映的是消费者的喜爱程度与购买倾向,与面包品质存在一定但非必然的关联。在面包外观、味道、酸度、口感、整体接受度这5个方面,FBG组最受喜爱,PTL组次之,DATEM组得分较低。其中,DATEM组酸度评分(5.96分)低于对照组(6.21分),可能与GC-MS检测出大量乙酸有关。在面包中使用DATEM产生酸味是一个普遍存在的现象,然而不影响对面包的整体接受度,这与Moayedallaie[2]的报道观点相一致。另外,有研究称酸类可增强面包的味道和口感[48]。PTL组面包的内部组织结构(6.82分)和气味(6.48分)嗜好得分最高,说明PTL在改善面包品质方面具有其独特优势。

图7 感官评定雷达图Fig.7 Radar map of sensory tests

3 结论

适量PTL能够增加面包体积及改善组织结构,最佳用量为10～20 mg/kg。过量PTL造成面包比容下降,气孔面积占比减小等不良影响。本试验中PTL对面包芯增白作用不显著(P>0.05),可能是受原料及其混合条件等限制。取不同添加剂(酶制剂和化学改良剂)的推荐用量中间值应用于面包发现,FBG在增大面包比容、强化面筋结构、提高感官整体接受度等方面效果最好,PTL次之,DATEM较差。且不同添加剂对面包质构具有不同影响,加入PTL后面包硬度显著降低(P<0.05),对内聚性和回复性也有一定程度的改善。GC-MS测定面包芯风味物质结果显示,脂肪酶FBG和PTL都能够明显增加风味物质的种类。加入DATEM产生大量乙酸掩盖了面包的香气。经九点嗜好法感官评定,PTL组面包在气味及组织结构方面得分最佳,分别为6.48分和6.82分。综上,PTL能有效改善面包的烘焙品质且具有不同于FBG的独特优势,这将为其在烘焙工业中的应用提供参考。