(江苏农牧科技职业学院食品科技学院,江苏泰州 225300)

银杏(Ginkgobiloba)是一种珍贵的药食同源资源,其种仁含有蛋白质、淀粉、脂肪、粗纤维、维生素、微量元素等营养成分及银杏黄酮、银杏多糖等具有特殊功能的微量活性物质[1]。银杏果具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、治疗心血管疾病等功效[2]。泰州是银杏之乡,拥有丰富的银杏资源,但开发利用较低,人们常将剥皮的银杏果作为煲汤炖菜的原料,虽然也小规模生产银杏奶茶、银杏酒、银杏月饼、银杏保健餐粉等产品,但巨大的产能和落后的生产技术之间的矛盾巨大,造成了大量银杏资源的浪费,因此,有必要加大银杏资源的开发和利用。

微生物发酵可产生复杂的酶系,对外源性底物进行结构的修饰和转化,产生众多活性成分和风味物质,提高产品的营养价值,改善产品风味[3]。乳酸菌和酵母菌是淀粉类原料发酵过程中常用的优势菌[4],乳酸菌与酵母菌之间存在共生与互补效应,酵母菌的代谢产物氨基酸、维生素和丙酮酸盐等可刺激乳酸菌活动,为乳酸菌提供营养物质,乳酸菌水解产物则为酵母菌提供了能量来源[5]。乳酸菌和酵母菌共生发酵制得的发酵乳饮料的蛋白水解程度、多肽抗氧化活性和感官均高于单一菌种发酵的结果[6];闫彬等[7]的研究表明:乳酸菌和酵母菌混合培养比单菌培养能得到更多的风味物质和甲酸、乙酸和丙酸;Tristezza等[8]的研究表明:乳酸菌和葡萄酒酵母混合发酵会缩短葡萄酒发酵时间,生成丁二酸二乙酯和乳酸乙酯,使葡萄酒具有黄油和奶油香味;李美伦等[4]利用植物乳杆菌、酿酒酵母和矮小假丝酵母混合发酵制作的米发糕相比较传统市售米发糕产生了12种特有风味物质,其中9种为酯类物质;刘英丽等[9]的研究表明,乳酸菌和酵母菌复配使用后醇类挥发性物质含量增多,并产生四甲基吡嗪物质。但未见银杏果通过生物发酵技术提高其营养功能和风味的报道。

本试验以乳酸菌和酵母菌为发酵剂,研究了不同的发酵方法组合对发酵银杏粉中的黄酮类物质、多酚类物质、可溶性蛋白质、可溶性糖、总抗氧化能力、挥发性香气成分的影响机理及变化规律,以期为地方银杏资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

银杏(大佛指) 泰州利群超市;淀粉酶、糖化酶 北京索莱宝科技有限公司;乳酸杆菌菌株SM-006 江苏农牧科技职业学院实验室选育,菌种为冻干菌粉;酵母菌 安琪酵母股份有限公司;总抗氧化能力(T-AOC)测试盒 青岛捷世康生物科技有限公司;没食子酸、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硫酸、乙醇、碳酸氢钠、磷酸、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、福林酚试剂、碳酸钠、苯酚、葡萄糖 等化学试剂均为国产分析纯。

7980B-5977A GC-MS气质联用仪 美国安捷伦科技公司;50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头 美国Supelco公司;T6-紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HH-6数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;RE-52D旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂;DHG-9101-2S电热恒温鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司;Scientz-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;5PX-250S·Ⅱ生化培养箱 上海三发科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵银杏粉的制备 新鲜银杏果去壳后预煮1 h,置于2‰的碳酸氢钠溶液浸泡2 h,于1‰盐酸溶液浸泡15 min,然后冷热水交替浸泡10 min,于清水中浸泡12 h后去芯,捣碎,于70 ℃的烘箱内干燥12 h。称烘干后的粉碎样100 g,溶于600 mL纯净水中,胶体磨研磨3 min,置于沸水浴中加热至100 ℃,保持15 min使淀粉充分糊化,取出后冷却至25 ℃,分别按照单酶解(M)、酶解+乳酸菌(M+R)、单乳酸菌(R)、乳酸菌+酵母菌(R+J)、酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)的工艺进行发酵,工艺条件如下:

单酶解(M):加入2‰和1‰的糖化酶和淀粉酶,于60 ℃的恒温水浴振荡器中搅拌酶解2 h后冷却至25 ℃。

酶解+乳酸菌(M+R):在单酶解的基础上,加入3 g/100 g乳酸菌冻干菌粉,搅拌均匀,30 ℃的恒温培养摇床发酵12 h。

单乳酸菌(R):以3 g/100 g的量加入乳酸菌冻干菌粉,搅拌均匀,30 ℃的恒温培养摇床发酵12 h。

乳酸菌+酵母菌(R+J):分别加入1.5 g/100 g乳酸菌冻干菌粉和酵母菌粉,搅拌均匀,30 ℃的恒温培养摇床发酵12 h。

酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J):在单酶解的基础上,分别加入1.5 g/100 g乳酸菌冻干菌粉和酵母菌粉,搅拌均匀,30 ℃的恒温培养摇床发酵12 h。

分别取出发酵液倒入平皿,保鲜膜封口后放入-70 ℃冰箱冷冻2 h后放入冷冻干燥机内冻干28 h,即为发酵银杏粉成品。

1.2.2 黄酮含量的测定 称取发酵银杏粉15 g,加入150 mL 70%乙醇配制成溶液,70 ℃水浴回流提取2 h,常温下6000 r/min离心15 min,上清液放入旋转蒸发仪,蒸发浓缩后转移至50 mL容量瓶,30%乙醇定容至刻度。以芦丁为标样,采用NaNO2-Al(NO3)3显色法[10]测定发酵银杏粉中黄酮含量。标准曲线方程为:y=8.9943x+0.0042(0～0.08 mg/mL,R2=0.9987),x为芦丁浓度,(mg/mL);y为吸光度。发酵银杏粉中黄酮含量(mg/g)=m1/m。式中:m1为样品中黄酮质量(mg),m为发酵银杏粉的质量(g)。

1.2.3 多酚含量的测定 称取发酵银杏粉2 g,加入50 mL 60%乙醇浸泡1 h,于90 ℃恒温水浴锅内提取2 h,反复提取3次。提取液7200 r/min离心20 min,取上清液真空浓缩,得多酚提取液[11]。以没食子酸为标样,采用福林酚法测定发酵银杏粉中多酚含量。标准曲线方程为y=1.9562x+0.0135(0～0.3 mg/mL,R2=0.9995),x为没食子酸浓度(mg/mL);y为吸光度。发酵银杏粉中多酚含量(mg/g)=m2/m。式中:m2为样品中多酚质量(mg),m为发酵银杏粉的质量(g)。

1.2.4 可溶性蛋白含量的测定 取发酵银杏粉0.5 g,加入Tris-HCl缓冲液25 mL,磁力搅拌提取0.5 h,于4 ℃、7000 r/min离心15 min,取上清液。以牛血清血蛋白为标样,采用考马斯亮蓝法进行测定发酵银杏粉中可溶性蛋白质含量。标准曲线方程为:y=5.1664x+0.0108(0～0.06 mg/mL,R2=0.9992),x为牛血清血蛋白浓度(mg/mL);y为吸光度。发酵银杏粉中蛋白质含量(mg/g)=m3/m。式中:m3为样品中蛋白质质量(mg),m为发酵银杏粉的质量(g)。

1.2.5 可溶性多糖含量的测定 取发酵银杏粉1 g,加入50 mL蒸馏水,60 ℃水浴回流提取2 h,于4000 r/min离心10 min,取上清液。以葡萄糖为标样,采用苯酚硫酸法进行测定发酵银杏粉中多糖含量。标准曲线方程为:y=2.4957x+0.0238(0～0.06 mg/mL,R2=0.9993)。x为葡萄糖浓度(mg/mL);y为吸光度。发酵银杏粉中可溶性多糖含量(mg/g)=m4/m。式中:m4为样品中可溶性多糖质量(mg),m为发酵银杏粉的质量(g)。

1.2.7 挥发性风味物质的测定 样品处理:称取3 g样品于固相微萃取样品瓶,60 ℃恒温加热平衡10 min,插入老化好的SPME固相微萃取萃取头(老化条件250 ℃,2 h),于60 ℃顶空吸附30 min,于气相色谱仪250 ℃解吸3 min。

GC-MS条件:色谱柱Hp-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为He,流速1.2 mL/min,不分流进样;进样口温度为230 ℃;溶剂延迟3 min;程序升温:初始温度20 ℃,保持5 min;以2 ℃/min升至30 ℃,保持3 min;以10 ℃/min升至250 ℃,保持10 min。

MS条件:电离模式:EI,70 eV;离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,传输线温度250 ℃,全扫描模式,扫描范围:35～550 m/z。

定性分析:GC-MS检测到的挥发性香气物质与NIST 14.L谱库进行匹配,匹配度≥80%的鉴定结果予以保留。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同发酵方法对营养成分的影响

2.1.1 不同发酵方法对黄酮含量的影响 黄酮类物质是银杏果仁中的主要活性成分,常与糖结合,以黄酮苷的形式存在[12]。不同发酵方法对黄酮含量的影响见图1。由图1可知,M+R+J组(17.06±0.82) mg/g最高,M+R组(13.91±0.58) mg/g、M组(13.05±0.89) mg/g均显著高于R+J组(8.02±0.33) mg/g和R组(8.05±0.52) mg/g(P<0.05),主要是由于糖化酶和淀粉酶水解了样品中的糖,打断糖苷键,释放出黄酮物质所致;M组和M+R组黄酮含量差异不显著,这是因为乳酸菌发酵底物为乳糖和葡萄糖,而黄酮类物质主要与多糖结合,所以乳酸菌发酵对黄酮含量影响不显著;M+R+J组黄酮含量最高,且显著高于M组和M+R组(P<0.05),主要由于酵母菌产生了纤维素酶、果胶酶、糖苷酶等,降低了细胞壁和糖苷键对黄酮类物质的阻滞所致[13]。

图1 不同发酵方法对黄酮含量的影响Fig.1 Effects of different fermentationmethods on flavonoid content注:不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05),图2～图5同。

2.1.2 不同发酵方法对发酵银杏粉中多酚含量的影响 多酚类物质是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分总称,具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗突变活性。银杏果仁中的多酚类物质主要是黄酮类、酚酸类等[11]。不同发酵方法对多酚含量的影响见图2。由图2可知,5组多酚含量差异显著(P<0.05),M+R+J组(46.62±1.97) mg/g最高,显著高于R+J组(38.64±2.63) mg/g(P<0.05)。这是由于多酚化合物通过疏水键和多元氢键与蛋白质、生物碱、多糖等生物大分子以结合态存在[14]。糖化酶和淀粉酶可水解样品中的多糖为可溶性糖,酵母菌和乳酸菌可分解大分子蛋白质为多肽和小分子可溶性蛋白质,使结合态的多酚类物质溶出。M+R组(31.92±1.21) mg/g显著低于M组(35.16±1.69) mg/g(P<0.05),R组(25.67±1.09) mg/g最低,这是由于乳酸菌发酵样品中糖类物质产生乳酸,抑制多酚氧化酶活性,减少多酚类物质的分解所致。

2.1.3 不同发酵方法对可溶性蛋白含量的影响 可溶性蛋白指可以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白,可溶性蛋白易被人体消化利用,是评价食品营养价值的重要指标之一。不同发酵方法对可溶性蛋白含量的影响见图3。由图3可知,M+R+J组(4.74±0.18) mg/g最高,与R+J组(4.59±0.12) mg/g差异不显著,两者显著高于M+R组(3.42±0.09) mg/g和R组(3.28±0.15) mg/g(P<0.05),M组(1.41±0.11) mg/g最低。主要由于乳酸菌和酵母菌发酵过程中均会产生蛋白酶,将产品中的蛋白质水解为具有一定空间结构但分子量较小的蛋白质,增加了蛋白质的溶解性[15]。乳酸菌产生的乳酸具有α-羟基结构的羧酸,能与多肽链上的基团形成氢键,也会促进蛋白质的溶出[16]。

图3 不同发酵方法对可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effects of different fermentationmethods on soluble protein content

2.1.4 不同发酵方法对可溶性糖含量的影响 可溶性糖是食品重要品质指标之一,赋予产品甜味,易于人体消化吸收。不同发酵方法对可溶性糖含量的影响见图4。由图4可知,5组产品中可溶性糖含量差异显著(P<0.05),M组(18.98±0.66) mg/g含量最高,这是由于糖化酶和淀粉酶均能水解淀粉和糊精为可溶性葡萄糖所致;M+R组(11.25±0.85) mg/g含量次之,是由于乳酸菌可以利用样品中的葡萄糖、果糖等可溶性糖发酵产生乳酸、乙醇等,使可溶性糖显著下降的同时,赋予产品特殊的风味;M+R+J组(7.61±0.91) mg/g显著低于M+R组(P<0.05),这是由于酵母菌不但可以消耗样品中的葡萄糖、果糖、麦芽糖等可溶性糖,乳酸菌发酵产生的乳酸还能促进酵母菌大量繁殖[7],进一步消耗样品中可溶性糖。R组(5.24±0.52) mg/g和R+J组(3.82±0.41) mg/g之间含量差异显著(P<0.05)也进一步说明了这一机理。

图4 不同发酵方法对可溶性糖含量的影响Fig.4 Effects of different fermentationmethods on soluble sugar content

图5 不同发酵方法对总抗氧化能力(T-AOC)的影响Fig.5 Effects of different fermentation methodson total antioxidant capacity(T-AOC)

综上所述,M+R+J组的黄酮类物质、多酚、可溶性蛋白、总抗氧化能力均最高,且黄酮类物质、多酚、总抗氧化能力显著高于其他4组(P<0.05);可溶性糖含量虽不是最高,但由于乳酸菌发酵产生了乳酸、乙醇等物质,赋予了产品柔和的酸味和浓郁的香气。

2.2 不同发酵方法对挥发性风味成分的影响

香气是食品的重要品质特征,由多种挥发性风味成分组成。不同发酵方法能产生一些有益风味物质,降低某些风味缺陷物质的含量,改变发酵产物的风味特征,提高产品品质[19]。将不同发酵方法制得的发酵银杏粉经处理后用气质联用仪结合计算机检索技术对风味成分进行鉴定,结果见表1。

由表1可知，不同发酵方式制得的发酵银杏粉中风味物质数目和相对含量(某风味物质占整体风味物质的比例)不同，共检测出102种风味物质，其中烃类45种，醇类17种，酯类12种，酸类11种，醛类9种，酚类4种，其他类4种。

表1 不同发酵方法制得的发酵银杏粉中挥发性风味成分含量Table 1 Contents of volatile flavor components in fermented Ginkgo biloba powder prepared by different fermentation methods

续表

续表

烃类化合物通常具有清香和甜香的风味，对整体风味有一定的贡献[20]。但饱和烃类具有较高的嗅觉阈值，对产品风味贡献较小。5种发酵方式制得的发酵银杏粉中烃类化合物相对含量均较高，但种类和数量差异较大。M组检测到16种烃类，相对含量41.95%，其中饱和烃类占全部烃类的比例为62.2%；R组检测到13种烃类，相对含量25.34%，其中饱和烃类占全部烃类的比例为90.6%；R+J组检测到10种烃类，相对含量18.23%，其中饱和烃类占全部烃类的比例为69.6%；M+R组检测到17种烃类，相对含量31.67%，其中饱和烃类占全部烃类的比例为80.0%；M+R+J组检测到18种烃类，相对含量30.10%，其中饱和烃类占全部烃类的比例为81.6%。乳酸菌参与发酵的产物中饱和烃类占全部烃类的比例均明显提高，可能由于饱和烃类是杂环物质的中间体，来源于脂肪酸烷氧基的均裂[21]，而乳酸菌代谢产物中含有促进脂肪酸烷氧基均裂的酶。

醇类物质一般存在于植物中，通常具有芳香和植物香的风味[22]。5种发酵方式制得的银杏粉中醇类物质种类和相对含量差异较大。M组检测到5种醇类，相对含量10.31%；R组检测到6种醇类，相对含量7.92%；R+J组只检测到1种醇类，相对含量2.38%；M+R组检测到5种醇类，相对含量8.72%；M+R+J组检测到7种醇类，相对含量最高为17.44%，其中独有成分2-3-丁二醇占全部醇类物质的比例为50.1%。2-3-丁二醇是4-甲基吡嗪的重要前体物质，吡嗪类物质具有青椒的香气和焙烤香，起着助香的作用[23]。

醛类物质分为饱和醛和不饱和醛。5种发酵方式生产的发酵银杏粉中的饱和醛除苯甲醛、2-壬烯醛、2-十二烯醛外，都属于饱和直链醛。饱和直链醛通常有令人不快、辛辣的、尖刺的气味[22]。M组中饱和醛相对含量最高，达11.90%，R、R+J、M+R组中饱和醛相对含量分别为9.52%、9.52%、7.14%，M+R+J组中饱和醛相对含量最低，只有2.38%，风味最清爽，闻不到刺激性气味。发酵银杏粉中不饱和醛主要是烯醛类化合物，烯醛类化合物通常具有清香、暗香，似亚麻油或奶油香的气味[23]。烯醛类化合物只有R组(2.38%)和M+R组(2.37%)中有，但含量均较低，对整体风味影响不大。

酚类化合物能够增加香气的丰满性，且具有一定的抗氧化功效[24]。5种发酵方式制得的银杏粉中酚类物质分别检出0、2、1、0、3种，相对含量均很低，但因其阈值低，对整体风味仍具有一定的影响。R组和R+J组中酚类物质相对含量分别为2.37%和1.58%，M+R+J组中酚类物质相对含量为3.95%，含量最高，其中丁香酚是特有成分，占全部酚类物质的比例高达40%，丁香酚具有典型丁香香气，且阈值很低[25]。

适量的酸味可赋予食品舒适、柔和的口味，既能增进食欲，又能使肠胃内的纤维素、钙等物质迅速溶解[26]。5种发酵方式制得的发酵银杏粉中的酸味物质含量差异较大，M+R+J组中检测到8种酸味物质，相对含量最高达13.46%，赋予了银杏粉柔和舒适的酸味；M+R、R+J、M、R组分别检测到2、1、2、1种酸类物质，相对含量分别为1.58%、2.38%、1.58%、0.79%，这些产品的酸味不突出，对整体风味几乎没有贡献。

挥发性酯类物质对食品风味的贡献较大，赋予产品令人愉悦的果香和酒香[27]。5种发酵方式中，只有M+R和M+R+J两组检测出挥发性酯类物质，分别检出1、6种，相对含量分别为8.7%和11.87%。癸酸乙酯和辛酸乙脂是M+R+J组中的代表性成分，这两种物质均是世界著名的法国白兰地酒如马爹利、人头马等中的特征风味组分[28]。

3 结论

不同发酵方法对产品中黄酮、多酚、可溶性蛋白、可溶性糖、总抗氧化能力影响明显。M+R+J组的黄酮类物质、多酚、总抗氧化能力均最高，且显著高于其他4组(P<0.05)。可溶性蛋白含量最高，可溶性糖含量显著高于R组和R+J组(P<0.05)。5组发酵产品中挥发性风味成分种类和相对含量差异明显。M+R+J组中检测到的醇类物质、酚类物质、酸味物质、挥发性酯类物质的相对含量均最高，这些物质赋予了产品酸香适宜、风味浓郁的风味；检测到的醛类物质相对含量最低，闻不到刺激性气味；检测到的烃类物质相对含量虽然不是最高，但由于5组中的烃类物质大多数为饱和脂肪烃类，嗅觉阈较高，对产品的风味影响较小。酶解后采用乳酸菌协同酵母菌发酵有利于发酵银杏粉中营养成分的析出和风味物质的富集，是最佳的发酵方法，可为银杏果仁的进一步开发利用提供技术支撑。