周伟宁 杜倩怡 钟志成 何天文 张艳霞 唐纯芳

(1.广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442；2.广东省妇幼保健院新生儿外科，广东 广州 511442)

染色体异常是导致出生缺陷最常见的遗传病之一，新生儿各种染色体异常的发生率约为1/160，主要包括数目异常和结构异常，其中数目异常更为常见[1]。常见的5条染色体数目异常包括21、18、13、X、Y，引起了80%～90%以上的有临床重大意义的染色体疾病[2,3]。随着产前诊断技术的发展，社会的科普及孕妇对其认识度的提高，诊断染色体数目异常的技术已在临床上得到普遍的应用，传统的染色体核型技术已经应用了很多年了，其金标准的地位至今没被取代，但其报告周期长，实验受环境影响大，有一定的失败率，孕妇及家属心情非常焦虑，不利于孕期健康，甚至可能引起医患矛盾[4]。因此，一项快速稳定的检测技术对染色体非整倍体的产前诊断非常具有临床价值。荧光定量聚合酶链反应(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)技术利用荧光引物对染色体上特异的多态性短串联重复序列(short tandem repeat，STR)位点进行扩增，通过毛细管电泳，用荧光变量双峰的比值对染色体数目进行判断，这种技术方法具备快速、方便、成本低、通量高等优点，而且还能进行污染鉴定，在国内外一些大型的产前诊断机构得到了广泛的应用[5-7]，这一技术在报告周期上比核型分析具有较大的优势[8]。很多孕妇对筛查高风险非常的恐惧，QF-PCR能在48小时内出结果，结果阴性就基本排除了80%以上的染色体疾病，可以减轻孕妇的心理负担，对孕期检查有很大的指导作用。我们实验室的QF-PCR选择杂合度高的STR位点比一般实验室多，共24个，那准确率有多高呢？会不会出现假阳性或假阴性？本研究收集了产前诊断的病例标本4262例，将病例标本用QF-PCR和染色体核型分析两种方法检测后的结果进行比较，评估QF-PCR技术在大数据支持下的灵敏度和特异度，深入探讨QF-PCR在染色体非整倍体产前诊断应用中的能力。另外，需要进行QF-PCR检测的原因有好几种，我们统计染色体非整倍体在不同的产前诊断指征中的阳性率，了解数据对临床咨询的参考意义。

1 资料与方法

1.1 基本资料 收集2018年1月1日至2018年12月30日在广东省妇幼保健院医学遗传中心门诊进行产前诊断的高风险孕妇的标本，并用QF-PCR共成功检测4262例，染色体核型分析成功检测4254例，8例培养失败。高风险的指标包括孕妇年龄≥35岁、唐氏综合征血清学筛查高风险、无创产前基因筛查高风险、超声软指标异常、染色体异常儿生育史等。

1.2 方法 所有进行产前诊断的孕妇都签署知情同意书，绒毛穿刺在11～14周，羊水穿刺在16～24周，脐血穿刺在24周之后。绒毛标本210例，羊水标本3940例，脐血标本112例。羊水标本采集20ml，其中15ml用于核型分析，5ml用于QF-PCR；脐血标本2ml，1.5 ml用于核型分析，0.5 ml用于QF-PCR。

1.2.1 染色体核型分析 核型分析首先按照常规细胞培养，制片G显带，参照 ISCN(2009)标准进行核型分析。

1.2.2 QF-PCR

1.2.2.1 DNA提取预处理 ①绒毛：在显微镜下挑取绒毛2根，用生理盐水清洗后加入蛋白酶K和ATL组织裂解液200μl，56℃水浴5～10分钟直到组织溶解；②羊水：2200rpm/min离心10min，去上清留细胞液200μl；③脐血：混匀后取200μl。

1.2.2.2 采用QIAGEN试剂盒对预处理的标本按照说明书提取步骤进行处理。

1.2.2.3 引物合成 引物设计从NCBI数据库中选取5条染色体中24个多态位点作为引物序列。13号染色体位点4个：D13S305、D13S628、D13S634 和 D13S742；18号染色体位点5个：D18S978、D18S386、D18S391、D18S535 和 D18S1002；21号染色体位点7个：D21S1411、D21S1412、D21S1414、D21S11、D21S2039、D21S1435、D21S1437，性染色体的STR位点8个：AMEL、SRY、DXS7423、X22、DXS1187、DXS981、DXYS218、DYS448。检测位点的引物上游5’端采用不同荧光标记，引物的合成和标记由TAKARA公司完成。

1.2.2.4 扩增 ①TAKARA公司的PCR反应混合液25μl，引物7.5μl，DNA模板5μl，总体积25ul。使用ABI9700PCR仪器进行扩增。②反应条件：95℃预变性5min后，94℃变性 30s，最适退火温度保温30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸60min，置4℃保存。

1.2.2.5 毛细管电泳检测 ①取9μl的上样液(甲酰胺8.6μl加分子内标internal lane standard 600 0.4ul)和1μl PCR产物混合；②PCR仪器95℃变性5min后放冰上5min；③ABI 3500测序仪采用POP-4凝胶进行毛细管电泳。

1.2.2.6 结果分析 ①将电泳数据结果导入软件Gene Scan3.7进行分析。②根据国际公认的判断标准(ACC/CMGS)对结果进行判断。正常：STR位点两个等位基因荧光信号峰面积比例在0.8～1.4之间。三体：STR位点等位基因扩增产物电泳后呈现3个荧光峰，峰面积的比例约为1∶1∶1；呈现的是双峰，比例>1.8或<0.65。如果STR位点的等位基因呈现的是单峰，认为是无效峰，每一条染色体必须要有两个以上STR位点异常才能判断为异常。

2 结果

2.1 QF-PCR检测结果 成功检测总例数4262例，正常3957例，占总例数92.8%，阳性数是305例，阳性率为7.2%，其中21-三体184例，占总阳性例数的60.3%，18-三体62例(20.3%)，13-三体24例(7.9%)，X单体12例(3.9%),XXY10例(3.3%)，XYY6例(2.0%)，XXYY2例(0.7%)，21-三体嵌合体3例(1.0%)，X/XX嵌合体2例(0.7%)。

2.2 染色体核型分析结果 送检标本4262例，成功检测4254例，其中有8例培养失败，成功率99.8%。在成功检测的4254例标本中，结果正常有3900例，占91.7%。阳性标本354(8.3%)，其中包括非整倍体300例(21-三体184例，18-三体62例，13-三体24例，X单体12例，XXY 10例，XYY 6例，XXYY2例)，46例结构异常和8例嵌合体。

2.3 两种方法验证对比 4262例QF-PCR检测标本用染色体核型分析金标准进行验证，其中8例培养失败，这8例标本用QF-PCR检测为阴性。将两种方法都成功地对4254例标本进行比较，304例非整倍体符合。结构异常共46例，不在QF-PCR 的检测范围内。核型分析检测出的8例嵌合体中，QF-PCR只检测出4例，漏诊率达50%。有1例嵌合体QF-PCR检测阳性，而核型分析是阴性(表1)。以染色体核型分析作为检测金标准，QF-PCR技术的灵敏度为85.9%，特异度为99.9%(表2)。把结构异常等不在检测范围内的标本剔除后的灵敏度和特异度分别为98.7%和99.9%(表3)。

2.4 不同产前诊断指征的染色体非整倍体的阳性率 根据这些孕妇的就诊病历，按最主要的产前诊断指征，我们大概分为以下常见几类，①唐氏综合征筛查高风险；②无创产前基因筛查高风险；③胎儿超声异常包括发育迟缓、脑室增宽、唇腭裂、羊水过多、羊水过少、心脏异常，脐血流异常等；④颈项透明层厚度(nuchal translucecy， NT)增厚； ⑤不良孕产史包括生育过唐氏患儿，胎死宫内等；⑥孕妇年龄≥35岁等等，笔者尝试对这些常见的高风险指标最终诊断为染色体非整倍体的阳性率进行分类统计，详细见表4。

表1 4262例样本产前诊断结果对比

表2 统计QF-PCR的灵敏度和特异度(例)

注：灵敏度=304/(304+50)×100%=85.9% ，特异度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示检测结果阳性；-表示检测结果阴性。

表3 统计QF-PCR的灵敏度和特异度(例)

注：灵敏度=304/(304+4)×100%=98.7% ；特异度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示检测结果阳性；-表示检测结果阴性。

表4 不同产前诊断指征的染色体非整倍体的阳性率(例)

3 讨论

大家都清楚染色体非整倍体疾病是一种危害非常严重的常见遗传病，其主要临床表现是发育迟缓，智力低下，多发畸形，甚至致死致残，给家庭带来沉重的精神压力和经济负担[9]。到目前为止预防染色体非整倍体患儿的出生目前主要还是对孕妇进行唐氏综合征血清学的筛查，高风险再进行无创产前基因筛查或产前诊断。染色体核型分析准确率高，金标准的地位依然未能动摇，但报告周期太长，孕妇及家属都会非常担心，而且标本需要培养，容易受环境影响，有一定的失败率，容易引起医患矛盾，这些都是染色体核型分析不可避免的缺点[10]。QF-PCR技术对标本要求较低，量要求较少，不需要培养，只要对标本提取DNA即可，失败率低，48小时内就能出报告，其非常重要一点是能够对产前诊断标本进行母血污染鉴定，这是很多方法不可比拟的优点[11]。QF-PCR同时也存在缺点，不能取代染色体核型分析单独进行产前诊断，如只能检测常见的5条染色体数目异常，不能检测结构异常，嵌合体和少数性染色体异常诊断会比较困难[12-13]，QF-PCR在产前诊断方面的诊断价值早期就有些文献报道，但数据都不是很大，QF-PCR灵敏度和特异度没有大数据的支持，对于一些嵌合体的检出率就更少了，而我们采用的STR位点非常多，杂合度高，在诊断方面更加的容易[14]。

本研究收集了1年的标本病例，回顾性分析了4262例QF-PCR产前诊断的标本，并每一例标本都和染色体核型结果进行对比，发现：①核型分析有8例标本培养失败，这8例标本QF-PCR都检测出来了，结果是阴性的，QF-PCR技术和染色体核型分析技术在常见5条染色体(13、18、21、X、Y)非整倍体的诊断符合率达98.8%。②核型分析发现8例嵌合体而QF-PCR只检测出4例，对于高比例的嵌合如30%以上，QF-PCR能起到提示作用，对于低比例的嵌合，QF-PCR技术也无能为力，这些观点某些文献已有报道[15]。而值得一提的是其中有1例标本QF-PCR提示是21-三体嵌合体，而染色体核型分析并没有发现异常，最后用FISH技术也检测出约35%比例的嵌合，对于比例并不低的三体嵌合核型分析未检出的原因科室也做了讨论，考虑羊水细胞在培养过程中，异常细胞被淘汰的可能，因此，染色体核型分析和QF-PCR结果不符合，需要第三技术进行验证，不能完全依靠核型分析做诊断。③参照染色体核型分析作为金标准，QF-PCR检测技术的灵敏度和特异度的是85.9%和99.9%，如果剔除结构异常等不在QF-PCR检测范围内的标本，在常见5条染色体(13、18、21、X、Y)非整倍体的检测范围内灵敏度和特异度分别为98.7%和 99.9%。

孕妇年龄≥35岁(高龄)、胎儿颈项透明层增厚、唐氏综合征血清学筛查高风险，这些都是发生染色体非整倍体的高风险指标，也是比较常见的产前诊断指征，除此之外，胎儿超声异常、不良孕产史等临床上都会建议行QF-PCR，核型分析，全基因组芯片分析等方法进行产前诊断，不同的指征最后诊断为(13、18、21、X、Y)非整倍体的阳性率究竟有多高，甚少文献报道，这对于临床医生的遗传咨询也有一定的指导价值，经过分类汇总发现无创产前基因筛查高风险阳性率最高，达到77.6%，其次是胎儿颈项透明层增厚、胎儿超声异常、唐氏筛查高风险，阳性率在8%～10%，高龄阳性率4.4%。高危妊娠、不良孕产史阳性率较低，分别为3.9%和1.0%，双亲染色体异常、IVF阳性率为零，这样分类的科学性和严谨性暂时没有找到文献的支持，但结果和我们的共识也很接近。

综上所述，QF-PCR技术在48小时内能成功地对常见5条染色体(13、18、21、X、Y)非整倍体进行快速诊断，灵敏度，特异度和成功率高，在低比例的嵌合体非常容易漏诊，但它也能发现核型分析因培养因素漏诊的嵌合体，因此，染色体核型分析和QF-PCR结果不符合，需要第三技术进行验证，不能完全依靠核型分析作诊断。另外关于不同产前诊断指征最终诊断为常见5种染色体非整倍体的阳性率，对临床医生遗传咨询有一定的参考价值。