王黎霞，宋丽聪 ，张建军，安 健*

(1.北京农业职业学院，北京 102442；2.北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206)

鸡球虫感染后入侵肠上皮细胞，引起鸡精神萎靡，肠黏膜损伤，临床血便，甚至死亡，严重影响家禽养殖业，全球每年因为球虫及球虫病造成的损失十分巨大，安健等前期研究发现，鸡柔嫩艾美耳球虫裂殖子入侵可以抑制MDBK细胞凋亡的诱导，深入研究入侵和凋亡抑制的机制，可以为研制新型抗球虫疫苗和治疗药奠定基础。

细胞凋亡时，线粒体跨膜电位发生改变，该情况与Bcl-2家族的凋亡因子有关，这些凋亡因子起抑制和促进凋亡两种作用，前者如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL等，起凋亡抑制作用，后者如Bax、Bak、Bid等，起凋亡促进作用[1]。Bcl-2是Ced9的同源物[1]。Bcl-2家族都有一个或者多个BH(硼氢酸特异结合位点)结构片段。试验证明Bax与Bcl调节细胞凋亡是依赖TM(单次跨膜区)结构域。凋亡早期，Bax与Bal-XL转移到线粒体膜[2]。Bad因为没有TM片段而存在于胞浆，诱导细胞凋亡时，转移到线粒体膜，除去TM后的Bcl-2抑制凋亡作用改变[3]。在无死亡信号刺激时，Bcl-2被膜蛋白包裹存在于胞质中[4]。当死亡信号刺激细胞后，Bcl-2发生构象变化，移动到细胞器(主要是线粒体)的膜上，导致细胞凋亡。以上两个分子主要定位于线粒体膜和内质网膜等[5]，在诱导剂的作用后，Bcl-2和Bcl-xl被蛋白激酶磷酸化而启动凋亡。Bax是最先被发现的促凋亡分子，Bid蛋白是Bcl -2家族中促凋亡类的蛋白，在细胞凋亡中起着重要的作用[6]。

本课题组前期试验发现，乙醇可以诱导细胞凋亡，发现鸡柔嫩艾美耳球虫裂殖子入侵体MDBK细胞2.5 h后可以抑制细胞凋亡的诱导，本试验在鸡柔嫩艾美耳球虫裂殖子入侵体MDBK细胞后，用终浓度6%乙醇进行凋亡诱导，采用qRT-PCR定量分析凋亡相关因子的变化，初步研究球虫裂殖子入侵细胞后抗凋亡诱导的机制。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

E.tenella，河北某鸡场分离，经过单卵囊纯化，保存于北京农学院 动物科学技术学院试验室；MDBK细胞，中国农业大学寄生虫试验室馈赠；胎牛血清、DMEM细胞培养基、胰酶(购自Gibco公司)。

1.2 试验方法

分离纯化裂殖子，参考安健等的方法[7]。

试验共分4组，A组，未入侵，未诱导凋亡；B组，未入侵，诱导凋亡；C组，入侵，未诱导凋亡；D组，入侵，诱导凋亡。MDBK细胞培养于125 cm2的斜颈培养瓶中,于37 ℃，5%CO2的细胞培养箱中培养24 h，胰酶消化，调整每瓶细胞达到3.0×105个,培养温度调至41 ℃，培养24 h后每瓶添加裂殖子9.0×105个，共培养1.5 h后，用Hank’s清洗细胞4次，除去未入侵细胞的裂殖子。用6%的乙醇培养基诱导凋亡培养2.5 h，然后胰蛋白酶消化3 min，收集细胞，用冷的PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，获得MDBK细胞，RNA提取、反转录按试剂盒说明进行。

根据GenBank中牛基因序列的CDs保守区设计Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid和内参基因β-actin的特异性引物(表1)，以β-actin为内参qRT-PCR检测Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid的表达变化，qRT-PCR检测按试剂盒说明进行。

表1 Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid和内参基因β-actin的引物序列Tab.1 Primiers of Bcl-2,Bax,Bcl-XL,Bid and β-actin for PCR

数据处理采用SPSS17.0软件进行，用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)进行多组间比较分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Bcl-xL基因表达变化

与未感染球虫未诱导凋亡组比较，各试验组Bcl-xL基因表达显著下调(P<0.05)，但感染凋亡诱导组基因下调显著大于未感染凋亡诱导组(图1)(P<0.05)。

注：A.未感染球虫，未诱导凋亡；B.未感染球虫，诱导凋亡；C.感染球虫，未诱导凋亡；D.感染球虫，诱导凋亡;a，b，c，d不同表示差异显著图1 球虫感染和凋亡诱导对Bcl-xL、Bid、Bcl-xL/Bid基因表达影响Note: A.no invasion and no apoptosis induced; B.no invasion and apoptosis induced; C.invasion and no apoptosis induced; D.invasion and apoptosis induced，a，b，c，d differences is significantFig.1 The differential expression of Bcl-xL, Bid, Bcl-xL/Bid gene under E.tenella invasion and apoptosis induced

2.2 Bid基因表达变化

与未感染球虫未诱导凋亡组比较，Bid基因攻虫凋亡诱导组表达下调，而未感染凋亡诱导组表达上调，且差异显著(P<0.05)(图1)。

Bcl-xL/Bid的比值攻虫凋亡诱导组表达均相对上调，而未攻虫凋亡诱导组表达均相对下调，且均差异显著，(P<0.05)(图1)。

2.3 Bcl-2基因表达变化

与未感染球虫未诱导凋亡组比较，未攻虫凋亡诱导组Bcl-2基因表达显著下调(P<0.05)，攻虫未凋亡诱导组显著上调(P<0.05)，攻虫凋亡诱导组基因表达下调量略低于凋亡组(图2)，但差异不显著。

2.4 Bax基因表达变化

与未感染球虫未诱导凋亡组比较，未感染凋亡诱导组Bax基因表达相对上调，攻虫凋亡诱导组表达相对下调，且差异显著(P<0.05)(图2)。

Bcl-2/Bax的比值攻虫凋亡诱导组表达均相对上调，而凋亡诱导组表达均相对下调，且均差异显著，(P<0.05)(图2)。

注：A未感染球虫，未诱导凋亡；B未感染球虫，诱导凋亡；C感染球虫，未诱导凋亡；D感染球虫，诱导凋亡a，b，c不同表示差异显著图2 球虫感染和凋亡诱导对Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax基因表达影响Note: A no invasion and no apoptosis induced; B no invasion and apoptosis induced; C invasion and no apoptosis induced; D invasion and apoptosis induced，a,b,c differences is significantFig.2 The differential expression of Bcl-2，Bax和Bcl-2/Bax gene under E.tenella invasion and apoptosis induced

3 讨 论

随着细胞生物学的迅猛发展，检测细胞凋亡的标志物也越来越多。其中Bcl-2和Bax的比值(Bcl-2/Bax)是比较易行且同时具有代表意义，该比值能够说明细胞发生凋亡的进程和结局。Bcl-2与Bax基因处于细胞凋亡通路调节的上游，在正常状态下，Bax与Bcl-2形成异源二聚体使细胞处于稳态。当受到凋亡信号刺激后，Bax被解离出来，形成同源二聚体从而诱导细胞凋亡。因此，细胞内Bcl-2/Bax的比值是决定细胞受到某种刺激后是否发生凋亡的重要因素。雷萍等(2012)[8]研究了灰树花提取物对脾虚小鼠脾脏Bax，Bcl-2表达的影响，证实了Bcl-2/Bax比值的提高可以抑制脾淋巴细胞的凋亡。雷博婷等(2015)[9]发现峨参提取物浓度的增加及作用时间的延长，Bcl-2/Bax的比值下降，肿瘤凋亡率增加。冯全服等(2015)[10]证明川芎嗪显著降低Bcl-2/Bax比值，诱导肿瘤HepG2细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖，且呈时间剂量依赖关系。冯颖等(2015)[11]证明胰腺实性假乳头状瘤退变区Bcl-2/Bax比值下调，实性区Bcl-2/Bax比值上调，因此Bcl-2与Bax表达的比率决定着细胞在受到凋亡刺激信号后是生存还是凋亡, 其比例增高对凋亡有抑制作用。

在本试验中，与未感染球虫未诱导凋亡组比较，未攻虫凋亡诱导组Bcl-2基因表达显著下调(P<0.05)，攻虫未凋亡诱导组显著上调(P<0.05)，攻虫凋亡诱导组基因表达下调量略低于凋亡组(图1)，但差异不显著，是由于加入凋亡诱导剂后Bcl-2基因表达受到抑制，使裂殖子感染早期抑制细胞凋亡。Bax基因未感染凋亡诱导组表达相对上调，攻虫凋亡诱导组表达相对下调，且差异显著(P<0.05)。Bcl-2/Bax的比值攻虫凋亡诱导组升高，而未感染凋亡诱导组下降，且均差异显著，(P<0.05)。说明裂殖子感染通过调节Bcl-2及Bax的表达量达到抑制宿主细胞凋亡的作用。

Bcl-2家族的另一对凋亡相关因子：Bcl-xl和Bid在细胞凋亡中也起着重要的作用，Bcl-xl蛋白通过抑制线粒体释放细胞色素C(Cyto C)[12]和凋亡诱导因子达到抑制细胞凋亡的作用，且Bcl-xl抗凋亡作用要强于Bcl-2，而Bid蛋白则可以增加这两种物质的释放从而促进凋亡[13]。张蕾蕾等(2015)[14]发现Zeylenone诱导宫颈癌细胞时Bcl-xL表达大幅下调，使其凋亡。郭文娟等(2010)[15]证实了Bcl-XL/Bid比值的降低与腺癌的发生相关，正常小肠组织中Bcl-XL/Bid比值要远远高于小肠腺癌组织。在死亡受体途径中，tBid进入线粒体，抑制Bcl-XL的表达。受到死亡信号的刺激后，胞浆中的Bid等因子会转至线粒体上，促进释放Cyto C，而线粒体外膜上Bcl-2和Bcl-XL则抑制Cyto C的释放[16]。线粒体释放出Cyto C后，Cyto C与Apaf-1结合，促进细胞凋亡[6]。在本试验中，Bcl-XL各试验组基因表达相对下调，但攻虫凋亡诱导组基因下调量大于未感染凋亡诱导组。Bid基因攻虫凋亡诱导组表达下调，而未感染凋亡诱导组表达上调，且差异显著(P<0.05)。Bcl-XL/Bid的比值攻虫凋亡诱导组表达均相对上调，而未感染凋亡诱导组表达均相对下调，且均差异显著，(P<0.05)。证明鸡柔嫩艾美耳球虫裂殖子抑制宿主细胞凋亡与Bcl-XL/Bid的比值呈正相关性。

综上所述，裂殖子入侵后通过抑制宿主细胞Bcl-XL/Bid，Bcl-2/Bax两对异源二聚体的解离抑制细胞凋亡。