周 蓉，曹 峰，刘 杨，陈开宇，郭宇弘，王雅霞

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp以下简称)是一种从胃黏膜内分离出来的螺旋状弯曲杆菌，与许多恶性肿瘤和非恶性疾病相关[1]，被国际癌症机构列为第一类致癌因子[2]，在人群中传播，全球人群感染率高达50%以上[3-4]，严重影响人类健康。目前认为幽门螺旋杆菌感染是能够预防胃癌最重要且可控的一个危险因素[5]。Hp感染关乎我国国计民生，更是消化科的热点，而根除它并非易事，抗生素的广泛应用使得治疗出现了瓶颈[6]，非抗生素的治疗越来越被研究者重视，目前已发现一些中药在Hp根除治疗中有可观的疗效，中药抗Hp研究也在医学界备受关注[7]，中国幽门螺旋杆菌治疗共识建议考虑将中药用于Hp根除。基于对地区环境及当地居民体质与前期研究等发现茯苓甘草汤能有效改善胃肠不适的症状，故开展茯苓甘草汤对Hp感染的研究。本文主要进行体外的抑菌实验研究，分析茯苓甘草汤及方中有效成分体外抑菌作用，探讨其治疗Hp的作用机制，为进一步研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 动物及菌株

动物：12只SD雌性大鼠，体重为180～220 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。

菌株：Hp SS1菌株，来自国家疾病控制和预防中心。

1.2 药物与材料

药物：实验所用到中药购于贵州同济堂药房：炙甘草片(生产批号：19060101)、茯苓(生产批号：1905101)、桂枝(生产批号：C190423)、肉桂(生产批号：C190426)、生姜购于农贸市场。

材料：哥伦比亚血培养基(生产编号：HB0124)、幽门螺旋杆菌添加剂(生产编号：HB8646a)、脑心浸液(生产编号：HB8297-1)、尿素酶试剂 (生产编号：GS004)、氧化酶试纸(生产编号：HB2100)、革兰染色试剂盒(生产编号：HB878)均购于青岛海博；无菌脱纤维羊血由河南巨石生物有限公司提供；麦氏比浊管由环凯生物有限公司提供；厌氧培养盒、微需氧产气袋来自日本三菱瓦斯化学株式会社；游标卡尺。

1.3 主要仪器

电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂) 、恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)、电子天平(日本岛津)、CX21型光学显微镜(日本Olympus公司提供)、高压灭菌锅(上海安亭)、无菌操作台等。

2 方法

2.1 培养基制备

固体培养基由哥伦比亚血琼脂培养基每93 mL加1支1 mL幽门螺旋杆菌添加剂作为抗生素+7%无菌脱纤维羊血，倾入无菌平皿。保存液制备：脑心浸液加30%甘油高压灭菌冷却，每1 mL分装入无菌保存管中。4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 Hp鉴定及菌液制备

在制作好的固体培养基上涂布平板法接种Hp菌液后放入微需氧环境下37 ℃恒温培养箱中培养48～72 h，超净工作台下打开后肉眼观察菌落生长情况，革兰染色显微镜下观察菌体形状，快速尿素酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验等方法检测细菌情况。检测结果均为阳性后将细菌进行保存，浓度用麦氏比浊法调至0.5麦氏浊度，即每管保存液中细菌浓度为1×108CFU/mL。

2.3 中药水煎液制备

将茯苓、炙甘草、生姜、桂枝、肉桂单味中药及茯苓甘草汤原方、肉桂方各药剂量按经方比例3∶2∶2∶1配制换算，8倍蒸馏水浸泡30 min后煎煮30 min，再用6倍双蒸水浸泡煎煮2次，将3次煎液合并后用双层纱布过滤，80 ℃热水浴挥发浓缩至1∶1水煎液，最后得水煎液中含生药量为1 g/mL。放入4 ℃冰箱中保存备用。

2.4 药敏纸片琼脂扩散法测抑菌圈直径

取6 mm无菌空白药敏纸片加入1 mL中药水煎液，浸泡过夜后取出纸片于干燥无菌管中密封，放入50～60 ℃烘干箱中干燥，直至干燥完全。取浓度为1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL，用一次性L棒充分涂匀平板，待菌液干燥后等间距的放置4个药敏纸片，将平板倒放在装有微需氧产气袋的厌氧培养盒中，充分密封后放入37 ℃恒温培养箱中培养48～72 h后取出，测量抑菌圈直径，同种药物重复5次。

2.5 打孔法测抑菌圈直径

用L棒均匀涂布浓度为1×108CFU/mL的Hp保存液100 μL于哥伦比亚血平板上，待菌液稍干燥后，用打孔的方法在平板上等间距打上直径为6 mm的小孔，每个小孔用移液枪注入不同药物水煎液50 μL，微需氧环境下恒温培养72 h后测抑菌圈直径，同种药物重复3次。

2.6 抗生素敏感度判定标准(抑菌圈直径标准)

高敏抑菌作用的抑菌圈直径>15 mm；中敏感度抑菌的抑菌圈直径10～15 mm；低敏感度的抑菌圈直径5～10 mm；无抑菌效果的抑菌圈为直径<5 mm或者无明显抑菌圈。

3 实验结果

3.1 Hp检测鉴定

用接种环挑取培养72 h后血平板上的少量菌落，快速尿素酶试验在约2 min左右变为玫红色(图1A)，白色氧化酶试纸蘸有细菌后立即变蓝色(图1B)，触酶试验立即产生大量气泡(图1C)，革兰染色显微镜下观察，有螺旋状、海鸥状，少量可见球状或杆状的革兰阴性菌(图1D)。显微镜下观察的形状与Hp相似，快速尿素酶试验、氧化酶试验、触酶试验均呈阳性，符合Hp理化性质，提示Hp培养成活。

3.2 药物水煎液抑菌作用的结果

药敏纸片法(见图2)测定茯苓甘草汤及单味中药抑菌圈直径结果见表1，打孔法抑菌圈直径结果见表2，综合两种测抑菌圈直径方法的结果可得出，甘草、生姜、茯苓甘草汤原方、肉桂方体外抑制Hp有中敏感度抑菌作用，桂枝、肉桂对Hp的抑菌作用较低，茯苓对Hp体外药敏纸片法抑菌中未见明显抑菌圈，打孔法边缘均有不同程度的Hp生长，由此判断茯苓对Hp无明显抑菌作用，将高敏和中敏视为敏感可得炙甘草、生姜、茯苓甘草汤原方及肉桂方为敏感。

注：鉴定结果：A.快速尿素酶试验阳性；B.氧化酶试验阳性；C.触酶试验阳性；D.显微镜观察(×100)

图1 Hp生化鉴定结果和显微镜

中医用药遣方主要讲究君臣佐使的配伍，通过药物复方之间相互作用来改善机体，在机体内产生药理效应，而单纯的药物水煎液未经过代谢的过程，无法真实反映体内量效关系，体外抑菌与体内杀菌存在一定程度的差距，为全面了解茯苓甘草汤对Hp的作用机制，在药物水煎液抑菌的基础上给动物灌入不同浓度方药水煎液后，在血清含药量达高峰时取动物含药血清进行体外抑菌实验。

3.3 含药血清抑菌测定

将茯苓甘草汤原方及肉桂方按剂量比例大小分为高、中、低剂量(40 g/kg；20 g/kg；10 g/kg)给大鼠灌胃连续7 d，后1 d连续2次灌胃，中间间隔2 h，末次给药3 h后腹主动脉采血放置1 h，离心抽取血清，灭活除菌，制备出含药血清，用打孔法(如图3)测定含药血清对Hp的抑菌作用，每组血清重复5次。结果如表3所示，得出茯苓甘草汤原方不同剂量对Hp的抑菌无明显差距，茯苓甘草汤肉桂方的高剂量较中、低剂量抗Hp敏感，原方的不同剂量与肉桂方中的高剂量均为中敏感度抑菌作用，可将茯苓甘草汤原方高、中、低剂量及肉桂方高剂量视为敏感。

注：1.茯苓甘草汤水煎液组；2.生姜水煎液；3.茯苓甘草汤等量替换的肉桂组；4.茯苓水煎液

图2 药敏纸片琼脂扩散法

注：均为茯苓甘草汤含药血清：1.高剂量组；2.中剂量组；3.低剂量组

组别药物浓度(g生药·mL -1)抑菌圈直径(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-113.03±0.85桂枝1.0g·mL -19.41±0.33生姜1.0g·mL -111.99±1.64肉桂1.0g·mL -19.12±0.48茯苓甘草汤原方1.0g·mL-111.84±0.85茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-112.09±0.97

组别药物浓度(g生药·mL-1)抑菌圈直径(mm)茯苓1.0g·mL-10甘草1.0g·mL-111.74±0.56桂枝1.0g·mL-19.21±0.42生姜1.0g·mL-112.90±0.29肉桂1.0g·mL-19.43±0.31茯苓甘草汤原方1.0g·mL-112.12±0.33茯苓甘草肉桂方1.0g·mL-111.56±0.19

中药名药物浓度(g生药mL-1)抑菌圈直径(mm)茯苓甘草汤原方5.0 (高剂量组)13.37±0.432.5(中剂量组)12.65±0.651.25(低剂量组)12.79±0.67苓甘草汤肉桂方5.0(高剂量组)12.46±0.662.5(中剂量组)9.70±1.241.25(低剂量组)9.41±0.76

4 讨论

我国是世界上人口最多的国家，Hp感染人口也最多，特别是饮食卫生环境差、经济较落后的地区感染率更高，贵州地区的平均感染率高于全国平均水平[8]。当前治疗Hp主流是依赖抗生素，取得了一定的疗效，但近年来发现抗生素耐药、副作用发生、疗效欠稳定的问题，使得Hp根除率受到了严重的影响，Hp根除的新路径是今后研究的方向，对Hp根除使用中医药治疗方法是一种新的选择。

中医没有关于Hp感染相关的病名，主要是通过整体观念来认识疾病的发生、了解疾病的发展，进而对疾病进行预防和治疗。大多数中医学者认为脾胃虚弱是Hp感染致病之本[9]，脾胃虚弱，运化无力而痰饮内生，体内脾胃阳气亏虚，失于温运则水湿停聚于体内。形成的痰饮水湿反作用为Hp在体内的附着、繁殖和致病提供条件。脾胃虚弱为Hp定植在胃黏膜上提供前提条件[10]，形成的水饮停聚于体内的现象又为Hp在胃黏膜的繁殖提供有利条件[11]，这一病变机理与中医的胃虚饮停证不谋而和，运用中医思维来治疗疾病，以扶正祛邪为基本治疗原则，代表方为茯苓甘草汤。茯苓淡渗利水，桂枝通阳化气，生姜温胃阳辛散水气，甘草健脾和中，调和诸药，四药共奏温胃化饮、通阳利水之功效来治疗Hp感染引起的疾病。

茯苓甘草汤中茯苓、生姜、甘草均属药食同源之物，安全性高。组方中的桂枝与药食同源的肉桂来自同一樟科植物的一部分[12]，为了使药物组方更安全，实验结果被推广应用，以及能够在日常生活中自行食用预防性用药的角度考虑，在开展茯苓甘草汤对Hp的研究时，增加一组将全方中桂枝同等量换为肉桂的茯苓甘草肉桂汤方进行实验比照。

本次实验中发现茯苓经过多次抑菌圈测定都无抑菌作用，早期文献中也有报道[13]，但近期有研究报道茯苓水提物对Hp有一定抑菌作用[14]，与本次实验有差异，考虑药物提取存在差异，有抑菌作用的茯苓实验中茯苓多糖的抑菌作用较茯苓水煎液差，说明茯苓抑制Hp的主要成分不是多糖成分，实验用80 ℃回流提取，而本次实验是通过煎煮的方法，温度远超过80 ℃，考虑有效成分可能被破坏。中药体外抑菌是中医抗Hp研究的基础，为了真实有效对比抑菌情况，需要对中药材的生产进行严格的监控，中药的煎煮问题、药敏实验方法等都需建立起规范公认的方法。

本文根据当地为Hp高发地区，地处寒湿气候，当地居民喜食肥甘厚味、辛辣、酒食的饮食习惯，故痰湿体质多见，从中医角度认为Hp致病与胃虚水饮发病机制类似，治疗时从“温药和之”治疗思想考虑，故用茯苓甘草汤温胃阳化水饮治Hp，通过体外研究得到一定的验证，体内治疗Hp及茯苓甘草汤等质量替换肉桂的预防性实验，有待进一步研究。