李敏奇, 谢凌志, 陈永正, 袁伟成*

(1. 遵义医科大学 a. 药学院； b. 贵州省生物催化与手性药物合成重点实验室；c. 贵州省教育厅绿色制药工程研究中心，贵州 遵义 563000 )

细胞色素P450单加氧酶是来源最广泛的酶家族之一，普遍存在于原核生物和真核生物，并参与生物体内众多代谢反应，如甾醇和萜类化合物合成与修饰[1]。P450单加氧酶具有催化活性混杂性的特点，可催化羟化反应，环氧化反应和脱烷基化反应等许多氧化反应(Scheme 1)，因而在生物催化和合成生物学领域展现出极具吸引力的应用前景。然而，目前P450单加氧酶在生物催化方面仍然面临着许多瓶颈问题，例如：反应活性低、选择性不高以及催化稳定性差[2]。20世纪90年代Arnold等开发了酶体外定向进化技术，并广泛应用于许多生物酶催化性能的提升。通过定向进化可实现P450单加氧酶的催化活性、区域选择性和立体选择性等催化性能的改善，甚至可以改变P450单加氧酶的催化机制，实现更多非天然的生物催化反应[3]。

Scheme 1

在酶的定向进化过程中往往需要寻找一种有效的基因突变策略来建立一个丰富的突变体文库，常用引入突变基因的方法有易错PCR、定点饱和突变、DNA重组和DNA交错延伸等。除此之外，由于突变体文库样本量巨大，针对特定酶催化反应的定向进化还需建立一个与之对应的高通量筛选策略，用于从庞大的突变文库中快速和准确地发现优良突变体。传统的GC和HPLC分析方法虽然准确性高，但其筛选效率低，成本高。……