吉力扬，郝 婧，王国成，谢唯佳

（1中国药科大学药物化学教研室，南京210009；2天士力控股集团有限公司天士力研究院，天津300410）

肿瘤免疫疗法是继手术治疗、化疗、靶向疗法之后新的肿瘤治疗手段之一，被Science杂志推举为2013年度全球十大科学研究突破之首。近年来，以CTLA-4、PD-1通路为代表的免疫检查点抑制剂及嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）的成功，更加印证了肿瘤免疫疗法独特的优势与广阔的应用前景。干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）是DNA感受通路中的关键蛋白，对于固有免疫和适应性免疫启动具有重要作用［1］。STING作为信号转导接头蛋白能募集TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）并激活干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3），进而诱导Ⅰ型干扰素（IFN-α、IFN-β）的产生并调控抗肿瘤固有免疫应答反应［2］。作为一种治疗方法，肿瘤内注射STING激动剂已经在多种小鼠肿瘤模型中显示出显著的治疗效果［3-5］。

1 STING通路的生物学机制

1.1 STING蛋白的结构与功能

STING蛋白是与固有免疫应答密切相关的一种信号转导分子，在多种内皮细胞、上皮细胞和造血干细胞中均有表达，主要定位于胞内内质网、线粒体及微粒体的外膜上［6］。人源STING（hSTING）蛋白由379个氨基酸组成，可分为3个结构功能域，包括N端的4次跨膜结构域（TM1～4）、二聚化结构域和C端面向胞质内的结构域。一般认为STING蛋白N端的4个TM使其能够锚定于内质网上，二聚化结构域高度保守，可能与其活化功能有关，而球状的C端结构域含有多种信号基序，其C尾端结构域对STING有着自我抑制作用，是招募TBK1的关键基序［7-8］。hSTINGH232（又称 hSTINGR232H，R232H表示组氨酸His替代原有的精氨酸Arg）与环二核苷酸 c［G（2′，5′）pA（3′，5′）p］结合诱导构形变化。自由状态下的STING二聚体结构比较松散，呈“开放”状态。当二聚体间的U型沟槽被2′，3′-cGAMP占据时，二聚体会形成一个紧密的“关闭”状态（图1-A），并由4个标准的β-折叠片覆盖在结合沟槽上面，使得二聚体完全包裹结合的配体［9］。然而，也有研究发现当氨基苯并咪唑类化合物（di-ABZI）激活STING时，始终使STING保持在“开放”的状态，如图1-B所示［10］。这一发现提高了STING的激活无需封闭构象的可能性。总之，还需要更多的研究以了解STING构象如何调控信号通路的激活。

Figure 1 Crystal structure of cGAMP-STING（PDB ID:4 LOH）（A）and di-ABZI compound-STING（PDB ID:6 DXL）（B）

1.2 STING信号通路

由STING蛋白介导的cGAS-STING胞内DNA感受通路参与机体的固有免疫应答，在抗病毒感染、自身免疫疾病和肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用，其信号传导机制如下:在识别胞质内的DNA后，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）二聚化，催化GTP与ATP反应生成环二核苷酸cGAMP。cGAMP作为第二信使结合并激活STING蛋白，使其形成二聚体。二聚化后的STING蛋白从内质网转移至高尔基体再至核外周小体，招募细胞质中的TANK结合激酶1（TBK1），继而诱导干扰素调节因子 3（IRF3）磷酸化。然后，IRF3进入细胞核中引起干扰素β（IFN-β）和其他基因的转录，发挥生物学效应（图2）［11-14］。

1.3 STING通路在肿瘤免疫监控中的作用

STING通路在肿瘤免疫监控中具有重要作用。肿瘤细胞中存在持续的DNA损伤反应，这导致其细胞溶质中DNA的积累。Woo等［15］报道了宿主体内STING通路识别肿瘤细胞的主要机制:肿瘤来源的DNA被宿主的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）监测到并摄入其胞质中，随后激活STING通路，介导依赖STING的Ⅰ型IFN的产生。而多项实验研究表明，肿瘤特异性CD8＋T细胞的激活及淋巴细胞的浸润与由Ⅰ型IFN诱导的基因表达密切相关［16-18］。Ⅰ型IFN信号通路缺陷，如干扰素-α／β受体α链或信号转导和转录激活因子1（STAT1）缺陷，将会抑制 IFN的刺激效应，导致针对肿瘤相关抗原的T细胞减少［19］。由此而知，STING通路能够通过介导Ⅰ型干扰素的产生发挥抗肿瘤适应性免疫效应。

2 抗肿瘤STING激动剂

STING介导的天然免疫信号转导是体内生成Ⅰ型干扰素的重要途径之一。采用一定策略激活宿主体内肿瘤微环境中的STING，一方面可以产生Ⅰ型干扰素，促进交叉呈递和抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞反应；另一方面活化后的STING诱导趋化因子产生，有助于招募效应T细胞在肿瘤微环境中杀伤肿瘤细胞。此外，通过STING活化的免疫系统还可以提高对放疗的敏感性［20］。这些基本原理有助于STING直接激动剂的研究。

2.1 环二核苷酸类激动剂

微生物产生的 c-di-GMP（1），c-di-AMP（2），3′，3′-cGAMP（3）及人体内合成的 2′，3′-cGAMP（4）是STING的天然激动剂，结合STING后激活宿主的固有免疫应答［21-22］。然而，天然的环二核苷酸激动剂在候选药物特性方面存在明显的不足，例如其相对分子质量大于500，强极性使其难以透过细胞膜，且磷酸酯键易被水解，这些因素一定程度上限制了其临床应用［23］。

Figure 2 Model for cGAS-mediated cytosolic DNA sensing

Figure 3 Close-up of the2′，3′-cGAMP-STINGcomplex depicting key interactions

通过对 STING蛋白和2′，3′-cGAMP复合体晶体结构及化合物2′，3′-cGAMP的结构进行分析（图3），结果显示两个嘌呤碱基是与STING蛋白结合的核心基团，其通过多个氢键和 π-π堆积与STING结合。因此，可以将磷酸核糖的环状结构作为这类化合物的分子骨架，两个嘌呤碱基作为药效团，这为设计新型的环二核苷酸类激动剂提供了理论依据。全消除，其中约50%的小鼠存活超过150 d，且免受肿瘤的二次攻击［25］。2015年，Fu等［26］设计出STINGVAX，一种结合合成类环二核苷酸的肿瘤疫苗。实验观察到当结合 ML-RR-S2 CDA时，STINGVAX与PD-1免疫检查点抑制剂联用可明显提高抑瘤效果。目前，针对ML-RR-S2 CDA（也称作MIW815或ADU-S100）的安全与有效性已开展人体临床Ⅰ期试验，用于治疗晚期转移性的实体肿瘤与淋巴瘤。

2014年，Li等［24］鉴别出一种外核苷酸磷酸二酯键水解酶，名为ENPP1。ENPP1能够水解天然环二核苷酸2′，3′-cGAMP。研究人员在这个基础上设计了一系列双硫代抗水解的衍生物，命名为2′，3′-cGsAsMP。体外实验显示这种经过修饰的激动剂结合 STING的能力与 2′，3′-cGAMP相当，但在人THP1细胞中诱导产生Ⅰ型干扰素的能力是后者的10倍。其中，代表化合物ML-RR-S2 CDA（5）拥有高稳定性和高的抗肿瘤效应，能够激活所有的hSTING变体。在小鼠的B16黑色素瘤肿瘤模型中，瘤内注射ML-RR-S2 CDA可显著抑制肿瘤生长。实验结果显示，大多数受治疗的小鼠肿瘤完

MK-1454是默沙东公司开发的一种STING激动剂，用于治疗晚期转移性实体瘤与淋巴瘤，目前也正处于Ⅰ期临床试验研究阶段。有结果显示MK-1454作为单一疗法无应答或部分应答，在与Keytruda的联合治疗中产生部分应答，相关的数据分析试验仍在进行中［27］。目前该公司尚未公开MK-1454的结构，涉及此类激动剂的化合物专利有3个。其中，代表化合物6和化合物7在体外THP-1细胞测定中显示诱导分泌Ⅰ型IFN的能力明显优于2′，3′-cGAMP，化合物 8的 EC50达到了 1 nmol／L［28-29］。

葛兰素史克（GSK）公司的研究人员对 2′，3′-cGAMP中核糖上的自由羟基进行取代修饰，引入F原子，得到化合物9。在对BALB／c小鼠乙肝表面抗原（HBsAg）模型的体内研究中，化合物9与参考激动剂 cGAMP均可调节HBsAg的免疫应答［30］。目前由该公司开发的STING激动剂GSK-532处于临床前研究阶段，虽然其结构尚未公开，但根据该公司申请的关于此类激动剂仅有的一项化合物专利，推测其结构由化合物9改造而来。体外配体实验显示GSK-532与hSTING结合的Kd为3.3μmol／L，体内实验中GSK-532对 CT26细胞移植瘤具有显著抑制作用［31］。

此外，处于临床前研究阶段的CDN类激动剂药物还包括 Spring Bank Pharmaceuticals公司的SB-11285和百时美施贵宝（BMS）与IFM Therapeutics公司联合开发的BMS-986301，二者的结构尚未公布。根据已有临床前研究结果，SB-11285在人单核细胞白血病细胞系中诱导依赖于STING的IFN和 NF-κB表达的 EC50为2和200 nmol／L，分别是2′，3′-cGAMP的 1 000倍与 200倍［32］。瘤内注射BMS-986301分别至CT-26和MC38小鼠肿瘤模型中，结果发现超过90%注射和非注射部位的肿瘤完全消退，而ADU-S100在相同的剂量下肿瘤消退率仅有13%。在CT-26模型中，BMS-986301与抗PD-1抗体的联合治疗引起80%注射与非注射部位肿瘤的完全消退，而单独使用抗PD-1抗体治疗时无效果［33］。

近期，几家公司又相继报道了一些新的CDN类STING激动剂化合物。Aduro公司与诺华公司报道了一类全新结构的环二核苷酸化合物作为STING激动剂，这类激动剂的结构特点是将化合物中核苷酸的2′位与4′位连接成闭环。其中代表化合物10在荧光测试中显示对野生型，HAQ型（STING突变型，存在R71H，G230A和R293Q 3个单点突变）和REF型（STING突变型，存在R232H单点突变）的STING均有较高亲和力。在荧光素酶报告基因检测中，化合物10在THP-1细胞中对HAQ型STING存在激活作用，EC50为 9.5μmol／L［34］。

Boehringer Ingelheim公司的研究人员报道了一类环二核苷酸类似物作为hSTING激动剂，在荧光测试中代表化合物11显示了对hSTING的高亲和力。在IRF诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因检测中，化合物11激活了人类急性单核细胞白血病THP-1 Blue ISG细胞的hSTING活性，其EC50为0.17μmol／L。对雄性 C57BL／6NRj小鼠静脉注射给予 10μmol／kg化合物 11，在 0.25、0.5、0.75、1和 2 h时血药浓度分别为 2 710、1 280、595、260和 111 nmol／L［35］。

Lioux等［36］设计了一系列新颖的环腺苷酸肌苷酸单磷酸类化合物，通过变化核糖上的取代基团，核苷酸间的连接位置和磷酸上的修饰筛选出了11个能激活STING信号通路的cAIMP类似物，并初步总结出这类化合物的构效关系（图4）。

Figure 4 General structure of the cAIMP analogs

（1）核苷酸间的连接方式影响化合物的稳定性和产生Ⅰ型干扰素的活性。实验观测到2′，3′连接与3′，3′连接结合STING的能力相同，后者诱导产生Ⅰ型干扰素的活性更高。而cGAMP中2′，3′-cGAMP与 STING的结合力约为 3′，3′-cGAMP的300倍，这体现出cAIMP与cGAMP不同的构效关系。（2）五碳糖上2′位双脱氧取代能够提高或降低对酶的稳定性，取决于酶的特异性。2′位氟代导致产生Ⅰ型干扰素的活性明显提高，其中双氟代化合物的活性最强。（3）硫代磷酸酯修饰显著提高了这类CDNs的体外稳定性和活性，并在小鼠体内肿瘤模型中表现出优良的抗肿瘤免疫效能。与人源 STING激动剂 2′，3′-cGAMP相比，体外细胞试验表明这类激动剂中某些化合物诱导产生IFNs和NF-κB的能力更强，较之2′，3′-cGAMP对内切酶更加稳定。体内试验显示化合物 3′，3′-cAIMP的EC50为6.4μmol／L，其衍生物的 EC50为 0.4～4.7 μmol／L，较 2′，3′-cGAMP（EC50为 19.6μmol／L）显示出更好的活性。

综上所述，主要从3个方面来进行CDN类激动剂药物设计的考虑:第一，通过部分或全部取代2′，3′-cGAMP中不稳定的磷酸二酯键，增加化合物在人体内的稳定性，减少电荷对分子跨膜转运的影响；第二，用其他一些基团取代核糖上的自由羟基，避免化学合成中羟基的保护与脱保护、选择性差与难分离；第三，由于碱基是此类化合物与STING结合的重要作用位点，应考虑原有碱基能否被其他碱基或类似物替代等。

2.2 非CDN类小分子激动剂

虽然当前STING激动剂的开发聚焦于模拟内源性蛋白配体cGAMP上，但是对于新型结构的非CDN类STING小分子激动剂的探索研究也逐渐成为研究热点。基于STING蛋白结合环二核苷酸类化合物的高分辨率晶体结构的报道，采用合理药物设计，药物化学家们已经合成筛选出一些兼具体内外功效的新的分子实体。

2.2.1 DMXAA 黄酮乙酸（FAA，化合物12）被证实通过破坏血管对小鼠结肠肿瘤有着显著的抑制活性。然而，随后的Ⅰ期临床试验的失败以及大鼠肿瘤模型中显示无活性，提示可能存在物种特异性［37］。为了获得可使肿瘤发生出血性坏死的类似药物，研究人员对FAA的分子结构进行进一步修饰，合成了一系列化合物，其中5，6-二甲基呫吨酮-4-乙酸（DMXAA，化合物13）的效果最好。DMXAA在不同的小鼠模型中显示抗肿瘤活性，同时也在大鼠的乳腺癌肿瘤模型中显示抗肿瘤活性［38］。然而，对其联合化疗用于治疗非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验宣告失败。对小鼠和人STING的结构-功能研究表明，DMXAA是鼠源 STING（mSTING）特异性激动剂，对人源STING并无激动效果，从而解释了用于人体治疗时的临床活性差异［39］。

2.2.2 氨基苯并咪唑类化合物 2018年11月，GSK公司的研究人员在Nature杂志上报道了一类新型结构的氨基苯并咪唑类激动剂（ABZIs）。研究人员运用高通量筛选方法得到一系列可以抑制3H-cGAMP与STING结合的小分子ABZIs类化合物。其中，代表化合物14在10μmol／L时的抑制率为（59±8）%，表观抑制常数 IC50约为（14±2）μmol／L。晶体结构分析表明，STING蛋白C端结构域（CTD）二聚体形成的口袋中结合了相邻的两个化合物14，每个小分子各自结合1个STING亚基。化合物14的N-1位上基团-CH（OH）-Ph虽落在结合口袋中，却与STING蛋白没有相互作用，因此研究人员将N-1位羟甲苯基替换成linker从而将2个ABZI连接成一个新的二聚分子，形成化合物15，其结合能力提升了近千倍。如图5所示，化合物15的1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺部分结合在口袋的底部，吡唑氮部分与Ser162的羟基之间形成关键的氢键，羧酰胺部分与Thr263形成氢键，末端酰胺与Ser241形成2对H键网络，维持复合物的构象稳定。化合物16是在化合物15的基础上进一步优化而成，亲和力及细胞内效能进一步提高，EC50约为 130 nmol／L，是化合物 15的20多倍。小鼠实验中观察到化合物16激活了适应性免疫，产生持久的抗肿瘤效应并引起肿瘤消退［10］。

Figure 5 Close-up of diABZI compound 15 binding in the ligandbinding pocket of STING

2.2.3 苯并噻吩类化合物 默沙东公司的研究人员报道了一类苯并噻吩结构型的STING激动剂，根据该公司公布的专利，体外测定显示在THP-1细胞中代表化合物 17的 EC50达到 531 nmol／L［40］。在MC-38细胞移植瘤雌性C57BL／6J小鼠体内实验中，化合物18与抗PD-1单克隆抗体mIgG1（鼠源免疫球蛋白G亚型1）联用时较单独使用mIgG1显著抑制肿瘤生长。该公司在专利中描述了将此类化合物与PD-1拮抗剂联用的策略，用于晚期转移性实体瘤和淋巴瘤患者治疗，目前已进行了Ⅰ期临床试验研究，但其结果尚未公布［41］。

2.2.4 其他类化合物 此外，Sali等［42］利用高通量筛选鉴定出一种hSTING特异性激动剂G10（化合物19）。G10在人成纤维细胞中显示出诱导针对甲病毒的抗病毒反应，对基孔肯雅病毒（CHIKV）的抑制活性 IC90达到 8.01μmol／L，不过其体内生物活性和药理学性质有待确定。Kimura等［43］报道一个新的化合物SINCRO（化合物20），并发现该化合物除了激活STING外，还可以通过不依赖于STING的细胞毒作用发挥抗肿瘤效应，目前不确定SINCRO是否直接与STING蛋白作用。Liu等［44］使用高通量筛选的方法从16 000多个化合物中筛选出一个二螺二哌嗪结构的化合物（化合物21）。该化合物通过依赖于功能性人源STING的方式诱导细胞因子表达，对小鼠STING无激动效果。这一激动剂丰富了哌嗪类靶向STING在治疗病毒感染或肿瘤方面的应用。

3 总结及展望

与瓶颈，但是依然有可能成为免疫疗法的又一个新兴热点。

STING蛋白是目前较为新颖的药物靶点，在研药物及专利申请数目比较有限。虽然目前尚未完全了解STING的确切作用机制，但越来越多的证据表明，STING激动剂有望应用于肿瘤的免疫治疗。尽管如此，STING激动剂的研究仍存在着许多问题，例如:在肿瘤细胞死亡后宿主的APC细胞如何获得肿瘤来源的DNA尚不清楚；除了放射疗法外，激活STING通路在其他肿瘤疗法（如化疗）中，与激酶抑制剂联用中的功效作用仍有待确证。此外，关于STING通路的调控方面的研究还不够深入，已知负反馈机制的表征将有助于建立更准确的策略来调节STING信号通路用于治疗用途。总之，目前STING激动剂的研发虽然存在许多限制