王浩 周小平

摘要：目的 观察补益营卫方对衰老小鼠表皮角蛋白（Keratin，K）18的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。方法 传代培养年轻小鼠与自然衰老小鼠表皮细胞，将衰老小鼠表皮细胞分为2组，一组常规培养，一组用含2.5%补益营卫方培养基培养。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）分别检测细胞K18蛋白、mRNA表达水平。结果 与年轻组比较，老年组K18蛋白与mRNA表达水平显著升高（P<0.05）;经2.5%药物干预后衰老表皮细胞中K18蛋白与mRNA表达水平较老年组降低（P<0.05）。结论 补益营卫方通过抑制衰老皮肤表皮K18蛋白及mRNA表达而延缓皮肤衰老。

关键词：营卫;皮肤衰老;角蛋白18;中医药

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2020）02-0017-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Buyiyingwei Prescription on epidermal keratin 18 （K18） in aging mice and to explore the mechanism of Buyiyingwei Prescription to delay skin aging. Methods： The epidermal cells of young mice and natural aging mice were subcultured. The senescent mouse epidermal cells were divided into two groups. One group was routinely cultured and the other was cultured with 2.5% tonic Buyiyingwei Prescription medium. Western blot and real-time PCR were used to detect the K18 protein and mRNA expression levels of the cells respectively. Results： Compared with that of the young group， the expression levels of K18 protein and mRNA in the elderly group were significantly increased （P<0.05）. The expression levels of K18 protein and mRNA in the senescent epidermal cells were reduced after 2.5% drug intervention compared with that of the elderly group （P<0.05）. Conclusion： Buyiyingwei Prescription can delay skin aging by inhibiting the expression of K18 protein and mRNA in aging skin.

【Key words】 Yingwei， skin aging， keratin 18， traditional Chinese medicine

我国正在发生深刻变化，人民的需求日益增长[1]。永葆青春，一直是人们追求。皮肤衰老，是人体最直观的衰老，严重影响了人的外在形象。中医理论认为营卫与皮肤及皮肤衰老有密切的关系。《内经》认为“五七，阳明脉衰，面始焦”，营卫化生于中焦脾胃，皮肤腠理是营卫交会的场所。随着年龄的增加，营卫生成来源不足，足阳明胃经气衰，脏腑组织失于营养，瘀血、痰浊内生;经络、腠理、络脉壅塞，营卫弥散、交会、气化障碍，营卫的营养、防御等功能减退，导致面部皮肤衰老[2]。补益营卫方由人参，生黄芪，炙甘草组成。方味虽少，但配伍精当。方中人参味甘，微苦，性平，具有补气与阴液双重作用;黄芪味甘性温，入表实卫，再加益气调和的炙甘草，共奏补益营卫之功效。本实验拟在中医营卫理论指导下研究补益营卫方对衰老表皮结构蛋白K18的影响，探讨补益营卫方对衰老表皮结构蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物 补益营卫方组成：人参、生黄芪、炙甘草。由本校药学院中药制备教研室加工、浓缩成1 g/mL（每毫升含1 g生药），用时用蒸馏水配制成所需浓度。胎牛血清（澳GIBCO）;DMEM（High Glucose）及磷酸盐缓冲液（BI）;D-Hanks液、中性蛋白酶（北京酷来博科技有限公司）;K-SFM角质细胞培养基（深圳市阿拜尔科技发展有限公司）;Trizol试剂（BioFlux公司）。

1.2 实验动物 清洁级昆明种雌性小鼠，3月龄（年轻组）1只;14月龄（老年组）10只。均由宁夏医科大学动物中心提供。本研究所有动物实验操作，经过宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会审核，符合国家实验动物福利伦理的相关规定。

1.3 仪器 HF-90恒温CO2培养箱（Thermo Scientific）、CKX31倒置顯微镜（OLYMPUS Corporation）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、PCR梯度扩增仪（北京索莱宝生物有限公司）、Rotor-Gene 3000 RealTimePCR仪（Corbett Research）等均由宁夏医科大学科技中心提供。

2 方法

综上所述，可以看出补益营卫方通过有效抑制衰老皮肤表皮K18蛋白及mRNA表达而延缓皮肤衰老，其深层机制涉及抑制细胞凋亡。

参考文献：

[1]廖小琴.新时代我国社会主要矛盾的逻辑生成与实践指向[J].马克思主义与现实，2018（2）：188-195.

[2]周小平，傅延龄.营卫与皮肤及皮肤衰老的关系探讨[J].四川中医，2008，26（4）：22-23.

[3]陈晓梅，周小平，郭维，程亚楠.补益营卫方对衰老表皮脂质代谢的影响[J].中华中医药学刊，2018，36（9）：2192-2195.

[4]程亚楠，周小平.补益营卫方对衰老表皮脂质屏障的影响[J].时珍国医国药，2018，29（2）：257-259.

[5]司晓伟，周小平，叶景阳，等.补益营卫方对衰老皮肤表皮角蛋白K19的影响研究[J].时珍国医国药，2016，27（12）：2828-2830.

[6]司晓伟，周小平.补益营卫方对衰老小鼠皮肤表皮角蛋白K5、K16表达的影响[J].中医杂志，2016，57（13）：1142-1144.

[7]司晓伟，周小平.补益营卫方对衰老皮膚表皮凋亡指数的影响[J].辽宁中医杂志，2016，43（5）：1080-1082+11.

[8]高黎，贾春华.基于《中华医典·医案》文献挖掘的调和营卫用药规律研究[J].福建中医药，2018，49（2）：47-49+52.

[9]Cerella C，Grandjenette C，Dicato M，et al.Roles of Apoptosis and Cellular Senescence in Cancer and Aging[J].Current Drug Targets，2016.

[10]Pistritto G，Trisciuoglio D，Ceci C，et al.Apoptosis as anticancer mechanism：function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies[J].Aging，2016，8（4）：603-619.

[11]Tom Luedde，Neil Kaplowitz，Robert F.Schwabe.Cell Death and Cell Death Responses in Liver Disease：Mechanisms and Clinical Relevance[J].Gastroenterology，2014，147（4）.

[12]张超，殷波.CK18、CK19在前列腺癌中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学，2018，26（5）：737-740.

[13]曾晶，陈东妮，徐进.角蛋白与肿瘤[J].中国细胞生物学学报，2012，34（5）：88-95.

[14]Moll R，Franke WW，Schiller DL，et al.The catalog of human cytokeratins：patterns of expression in normal epithelia，tumors and cultured cells[J].Cell，1982，31（1）：11-24.

[15]Linder S，Havelka A M，Ueno T，et al.Determining tumor apoptosis and necrosis in patient serum using cytokeratin 18 as a biomarker[J].Cancer Letters，2004，214（1）：1-9.

[16]Schutte B，Henfling M，K Lgen W，et al.Keratin 8/18 breakdown and reorganization during apoptosis[J].Experimental Cell Research，2004，297（1）：0-26.

（收稿日期：2019-10-28）