张 苗,李建宽,葛 睿,孟静一,李青山,*

(1山西中医药大学中药与食品工程学院,基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室,晋中 030619;2山西医科大学药学院;*通讯作者,E-mail:sxlqs2012@163.com)

糖尿病是一种慢性代谢性疾病,国际糖尿病联盟(IDF)报告指出,到2045年,估计约有6.29亿或更多的糖尿病患者[1]。糖尿病的临床治疗主要集中于提高血胰岛素水平和改善组织的胰岛素敏感性,如磺脲类、二甲双胍、噻唑烷二酮类、肠降血糖素模拟物和二肽基肽酶Ⅳ(DDP-4)抑制剂[2-4]。然而,这些治疗的药物有很多副作用,例如血糖过低、体质量增加以及疗效随时间推移而降低,这都限制了药物在临床的应用[2,3]。越来越多的研究表明,多种天然产物在治疗糖尿病方面表现出潜在的优势,并且由于其潜在的作用和较小的副作用,成为糖尿病治疗研究的一个重要方面[4-7]。

桦褐孔菌(Inonotusobliquus(Pers.) Pil.)是一种珍贵药用真菌,属于胆子菌门多孔菌科的一种,传统上用于治疗胃肠道疾病、心血管疾病、癌症和糖尿病[8-10]。现代药理学研究表明,桦褐孔菌多糖具有多种生物活性,其中包括抗糖尿病作用[11-14]。桦褐孔菌广泛分布于北半球北纬40°-50°的地区,如波兰、俄罗斯、日本北海道、中国黑龙江、中国吉林等国家和地区[10]。郭尚等[15]报道在山西省吕梁山地区也有桦褐孔菌分布。本文主要对采自山西吕梁山地区的桦褐孔菌对大鼠抗糖尿病活性及其对血脂调控、胰脏和肝脏损伤的保护作用进行探讨,为山西产桦褐孔菌的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

链脲佐菌素(STZ)来源于北京Solarbio生物科技有限公司;格列本脲购自天津太平洋制药有限公司;甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)和胰岛素(INS)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

旋转蒸发仪(EYELA N-1100S)购自日本东京理化器械株式会社(Tokyo,Japan);冻干机(FD8-3)购自美国GOLD-SIM公司(California,USA);Sinocare GA-3型血糖仪购自三诺生物传感股份有限公司(中国深圳);AV-400光谱仪购自德国Bruker公司(Rheinstetten,Germany)。

1.2 材料

桦褐孔菌采自山西省吕梁山地区,经山西医科大学药学院李建宽副教授鉴定为桦褐孔菌Inonotusobliquus(Pers.) Pil.。标本(2017002002)存放于山西医科大学药学院植物标本室。

1.3 IOTP的制备

1 000 g桦褐孔菌捣碎成粗粉。在90 ℃,用蒸馏水(5 L)提取3次,每次1.5 h合并提取液。过滤,将滤液用旋转蒸发仪60 ℃条件下浓缩至1/4。浓缩滤液中加入95%乙醇沉淀使其乙醇浓度为80%,放置过夜。次日离心(3 000 r/min,15 min)取上清,过D101树脂柱,水洗脱,得水洗脱液。将水洗脱液在冻干机上进行冷冻干燥,得桦褐孔菌总多糖(130 g)。将50 mg IOTP溶在0.5 ml的氘代水中,在AV-400光谱仪中检测1H-NMR。

1.4 动物分组及给药

SD雄性大鼠(160-180 g)50只购自北京斯贝福生物技术有限公司(证书许可证号:SCXK 2019-0010)。动物饲养条件如下:温度为(24±2)℃,相对湿度为(50±5)%,光照亮/暗循环12 h。动物自由饮食和进水。普通饲料购自北京斯贝福生物技术有限公司。大鼠饲养2周适应期后开展实验。

用新鲜制备的STZ柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH=4.5)60 mg/kg单次腹腔注射进行造模[16],1周后,检测血糖,血糖值高于11.1 mmol/L的大鼠被认为造模成功。造模成功的大鼠随机分为4组:模型组(n=10),阳性对照组(格列本脲,800 μg/kg,n=10),IOTP 400 mg/kg组(n=10)和IOTP 800 mg/kg组(n=10)。未注射STZ的大鼠(n=10)作为正常对照组。格列本脲和IOTP溶解在蒸馏水中,灌胃,每日一次,持续14 d。正常组大鼠和模型组大鼠口服相同量的蒸馏水。

1.5 采样及检测

每周测量体质量和空腹血糖值。治疗的第13天,各组大鼠禁食12 h后,进行口服葡萄糖耐受能力(OGTT)实验。口服葡萄糖(2.5 g/kg)溶液,分别于0,30,60,90,120 min收集尾尖血液,进行血糖检测。第14天,用10%水合氯醛麻醉动物,从腹主动脉收集血样并以3 000 r/min离心15 min收集血清,检测血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、LDH、INS的水平。取胰腺组织,经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后制成3 μm的切片用于HE染色,光学显微镜下观察并拍照。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 IOTP的1H-NMR

IOTP1H-NMR结果表明,在δ=3.0-4.0区间信号归属为IOTP糖上的质子信号(见图1)。δ=4.5-5.0区间信号归属为残留溶剂水的信号。

图1 IOTP的1H-NMR图

2.2 IOTP对糖尿病大鼠体质量、血糖和OGTT的影响

2.2.1 IOTP对糖尿病大鼠体质量的影响 与正常对照组相比,造模前的其余四组大鼠的体质量没有显著变化(P>0.05);与正常对照组相比,治疗2周后其余四组大鼠的体质量均显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.01,见表1)。

表1 IOTP对大鼠体质量的影响 (g)

Table 1 Effects of IOTP on body weight in rats (g)

组别n造模前 治疗2周正常对照组10264.30±36.17290.80±48.54模型组10229.00±10.69224.00±18.92∗∗阳性对照组10232.30±25.02231.30±22.62∗∗IOTP400mg/kg组10226.70±16.19204.60±30.45∗∗IOTP800mg/kg组10240.10±16.08237.30±19.41∗∗

与正常对照组相比,**P<0.01

2.2.2 IOTP对大鼠血糖的影响 治疗2周后,与正常对照组相比,模型组大鼠的血糖值显著升高(P<0.01);与模型组相比,IOTP两剂量组和阳性对照组大鼠的血糖值显著降低(P<0.01,见表2)。

表2 IOTP对大鼠血糖水平的影响 (mmol/L)

Table 2 Effects of IOTP on blood glucose levels in rats (mmol/L)

组别n造模1周 治疗2周正常对照组105.11±1.334.90±1.45模型组1014.19±1.5721.22±2.49∗∗阳性对照组1013.51±2.3117.03±3.29##IOTP400mg/kg组1013.89±2.1118.97±2.56##IOTP800mg/kg组1014.15±2.0112.66±3.63##

与正常对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,##P<0.01

2.2.3 IOTP对糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影响 口服葡萄糖后，所有试验组大鼠血糖水平在30 min内达到峰值，随后开始下降。阳性对照组和IOTP 800 mg/kg组，模型组和IOTP 400 mg/kg组血糖值在60，90，120 min时相比有显著差异(P<0.01，见图2)。

与模型组相比,**P<0.01

2.3 IOTP对糖尿病大鼠胰岛素和血脂的影响

与正常对照组相比,模型组大鼠的血胰岛素、HDL-C水平显著下降(P<0.01),TC、TG和LDL-C水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,IOTP两剂量组和阳性对照组血胰岛素和HDL-C水平显著升高(P<0.01),TC、TG和LDL-C水平显著降低(P<0.05,见表3)。

2.4 IOTP对糖尿病大鼠肝酶活性的影响

与正常对照组相比,模型组的AST、ALT和LDH活性显著升高(P<0.01)。与模型组相比,IOTP 800 mg/kg组和阳性对照组AST、ALT和LDH的活性显著降低(P<0.01,见表4),IOTP 400 mg/kg组AST和ALT活性显著降低(P<0.05或0.01),LDH活性虽然降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 IOTP对大鼠血胰岛素和血脂的影响

Table 3 Effects of IOTP on blood insulin and lipid profile in rats

组别nINS/(mU/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L) 正常对照组1029.42±0.461.08±0.250.32±0.102.44±0.232.08±0.37 模型组1010.02±1.14∗∗1.48±0.11∗0.58±0.08∗∗3.70±0.29∗∗0.66±0.12∗∗ 阳性对照组1022.13±0.71##0.85±0.19##0.24±0.08##1.43±0.41##1.46±0.49## IOTP400mg/kg组1019.44±0.41##0.97±0.14##0.38±0.08#2.91±0.69##1.45±0.22## IOTP800mg/kg组1022.44±1.64##0.95±0.20##0.25±0.02##1.32±0.41##1.01±0.15##

与正常对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01

表4 IOTP对肝酶ALT、AST和LDH活性的影响 (IU/L)

Table 4 Effects of IOTP on liver enzyme ALT、AST and LDH activities (IU/L)

组别nALTASTLDH 正常对照组1057.14±11.16108.20±11.07306.50±1.15模型组10272.50±13.69∗∗363.00±28.48∗∗574.60±12.88∗∗阳性对照组10139.70±16.35##172.00±26.29##323.80±38.83##IOTP400mg/kg组10130.50±16.98##230.80±70.39#545.80±18.85IOTP800mg/kg组10103.00±11.44##124.30±20.28##351.40±16.29##

与正常对照组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01

2.5 IOTP对糖尿病大鼠胰腺形态学特征的影响

模型组大鼠胰腺细胞出现明显的空泡化和胰岛萎缩。IOTP作用14 d后胰岛萎缩和胰腺细胞空泡化程度明显减弱,尤其在IOTP在800 mg/kg剂量下作用更显著(见图3)。

A.正常对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.IOTP 400 mg/kg组;E.IOTP 800 mg/kg组

3 讨论

糖尿病是一种慢性代谢性疾病,其发病率逐年上升,严重影响着人类健康。从中药中提取潜在的生物活性物质来有效控制糖尿病是一项重要策略。大量文献报道[16,17],STZ诱导的糖尿病大鼠模型简单有效,因而被广泛应用。阳性药格列本脲剂量的确定是根据市场上销售的药物格列本脲片人的有效剂量换算大鼠的等效剂量。成人每天服用格列本脲的有效剂量为7.5 mg。大鼠的等效剂量=成人每天服用的有效剂量×6.3÷人的质量=7.5 mg/60 kg×6.3≈800 μg/kg。本文研究结果表明,单次腹腔注射60 mg/kg STZ柠檬酸钠缓冲溶液可引起大鼠血糖显著升高,胰岛素水平和体质量显著降低。格列本脲和IOTP(400 mg/kg或/和800 mg/kg)可显著抑制STZ引起的大鼠高血糖和胰岛素水平。

本文实验中STZ诱导同时也引起大鼠血脂(TG、TC、LDL-C和HDL-C)水平的改变,这种改变在之前的文献中也有报道[18-20]。本研究中60 mg/kg STZ柠檬酸钠缓冲溶液引起大鼠TG、TC、LDL-C显著升高,HDL-C显著降低。然而IOTP能够显著降低TG、TC和LDL-C水平,升高HDL-C水平。因此,IOTP调节血糖的同时还能够调节血脂。

肝脏是机体重要的代谢器官。外源性STZ对大鼠肝脏损害的影响在以往的研究中已经有了较为全面的评价,血液中LDH、AST和ALT的活性被认为是肝损害的关键指标[21-23]。本文研究结果表明,IOTP对STZ诱导的糖尿病大鼠血清中LDH、AST和ALT活性的显著升高具有明显的抑制作用,表明IOTP对STZ诱导的肝脏损伤具有一定保护作用。

胰腺组织病理学表示,模型组胰腺细胞出现明显的空泡化和胰岛萎缩,形态结构发生病理学改变。IOTP治疗后胰岛萎缩和胰腺细胞空泡化程度明显减弱,且随着剂量的升高作用更强,表明IOTP能够抑制STZ诱导的糖尿病大鼠的胰腺损伤。

综上所述,采自山西吕梁山地区的桦褐孔菌对STZ诱导的糖尿病大鼠不仅具有显著降糖作用,而且能够调节血脂、抑制胰脏和肝脏的损伤。本文研究结果为山西产桦褐孔菌的进一步开发利用提供了科学依据。