李小康，鱼涛，李红，李金灵，屈撑囤，2

(1.西安石油大学 陕西省油气田环境污染控制技术与储层保护重点实验室，陕西 西安 710065；2.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206)

石油污染日益增多，对环境的破坏范围也逐渐扩大，给人们的生产生活造成严重影响。如何环保、无害的处理石油污染是当下环境治理需要解决的问题[1]。目前，在众多修复技术中，生物修复作为一种温和、环保、经济、操作简单的修复技术，对土壤生态恢复可起到很好的辅助作用，因此，生物修复技术成为土壤修复研究的热点。但是，由于微生物个体微小、抗性低、活性不稳定，在营养物质匮乏的石油污染土壤中极易失活，对土壤中污染物的降解效果较差[2]。研究表明[3]，通过添加外源刺激物可以提高微生物的降解活性和种群数量，缩短酶促降解周期，提高降解石油污染物的效率。

1 刺激物促进微生物降解石油污染物的机理

石油污染物进入环境中，单一营养物质不能维持微生物生长繁殖，需要额外添加一些刺激物质，并使用物理刺激方法增强微生物活性，提高微生物对石油烃的利用效率。多数刺激物质主要含有N、P、K、S等营养元素，可调节土壤的营养元素比例，为微生物修复土壤营造合适的生存环境。研究发现[4]，向土壤中投加营养物质会激活微生物体内酶的活性，增强微生物代谢系统对营养物质的分配和转运速率，保证原油在微生物体内被高效快速的分解。如图1所示，微生物在物理刺激(如通空气、电刺激等)作用下改变细胞膜性质，增强微生物和原油的接触，提高摄取效率。在营养刺激作用下，微生物加快对石油烃的分解代谢，提高合成代谢速率，短时间达到高数量、高活性，增强对原油污染土壤的修复能力。Wu等[5]研究表明，TPH的降解速率与微生物的种群数量和活性之间存在线性相关性。Witzig等[6]发现土壤中营养物质的含量过低，微生物体内酶的合成效率也会降低，代谢系统功能减弱。所以，生物刺激是提高含油污染土壤修复的必要手段。

图1 微生物刺激作用途径

营养刺激和微生物代谢也存在一定的关系。Thingstad等[7]利用monod模型方程探究了石油烃降解过程中的微生物生长率、微生物对原油和营养物质的摄取速率及微生物的实际呼吸速率，证明了营养物质的浓度会影响微生物对底物的摄取效率，影响微生物自身的呼吸速率、生物活性和生物数量。微生物与营养刺激关系模型方程如式(1)～(5)所示。

μ=μmax(1-f)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

2 不同类型刺激物对微生物的降解效果影响

通过生物刺激提高微生物降解石油污染的方法较多，分为化学刺激和物理刺激，化学刺激包含有机物刺激和无机物刺激，物理刺激可以通过物理作用改造微生物自身与它们的生存环境，提高微生物降解效率。

2.1 化学刺激对微生物石油降解

2.1.1 无机刺激物的种类及效果影响 石油污染修复过程中，无机刺激物主要以N、P化合物为主。Wu等[8]添加N、P无机盐刺激石油微生物处理含油污染土壤，石油烃类物质降解效率(60%)高于未添加无机盐的对照组(降解率仅为34%)，微生物活性和数量均比对照组高。合适的营养比例和加量也能进一步促进微生物对营养物质的摄取，减少过多的营养物质对环境的污染。王艳杰等[9]使用NH4NO3和 K2HPO4刺激微生物修复石油污染，发现土壤C∶N∶P为100∶10∶1 时，土壤生物量最高，比对照组高出40%左右，芳香烃降解率也达到43.89%。刺激物加量和微生物修复石油污染效果之间也存在规律，Khan等[10]利用NPK无机肥作为刺激物，显著提高了微生物对石油烃的修复效率，分析发现在一定的污染浓度和无机肥浓度范围内，污染处理效果随刺激物浓度的增加而增加。但是无机营养物质在土壤中容易随雨水流失，浓度变化较大，Xu等[11]使用包膜的无机营养肥料刺激微生物修复海滩残留的石油烃，对污染物中的烷烃降解率达到 95%以上，其中，包膜无机肥对土壤中微生物的作用效果比直接添加无机肥持续的时间更长，各组分营养浓度更加稳定。还有一些其它的无机刺激物都能很好地提高微生物的活性，增强微生物对污染物的降解，见表1。

表1 提高微生物降解效率的无机刺激物

微生物生长代谢需要从外界吸收各种营养元素，保障自身的物质循环和能量转化。Kalantary等[15]通过分析含不同元素化合物的添加对微生物降解多环芳烃的影响效果，结果发现元素对降解率影响大小为：N>K>P>Cl>Na>Mg>(Cu、Fe、B、Mo、Co、Ni)。Nolin 等[16]通过试验测得细菌细胞内各元素含量：N为1 163～5 390 mmol/L，K为128～462 mmol/L，P为106～642 mmol/L，Cl 为23～85 mmol/L，S为32～162 mmol/L，Mg为13～55 mmol/L。其中S、Cl、Mg在细胞中分布较为广泛。由此可以得出：某元素在胞内含量越高，分布越广泛，该元素对微生物降解石油烃的影响也越大，添加对应元素的化合物时，微生物的降解活性也会增加。但是同种元素所组成的不同化合物由于各自结构的差异，微生物对其吸收转化效率也会存在差别。

2.1.2 有机刺激物的种类及对微生物降解原油的促进效果 无机刺激物由于在土壤中存在时间短，容易改变土壤酸碱度和氮水比，给微生物代谢造成不利影响。因此，常使用有机刺激物增强微生物的活性和降解效率。氨基酸作为蛋白基本组成成分，常被用作肥料和微生物刺激物的主要成分。Zhang等[17]发现氨基酸复合肥的施用在促进植物生长的同时，也将土壤中的细菌数量提高1.57～2.18倍，加快细菌对土壤中有机物利用。近年来，研究利用血红蛋白作为刺激物促进微生物对石油烃的修复，效果十分显著[18]。王辉等[19]利用血粉作为刺激物，促进微生物对土壤中DDTs的修复，5个月后，降解率达到43.13%，比添加葡萄糖和乳化油的修复效率高出8%，血粉中含有多种氨基酸，可以为微生物降解提供丰富的氮源。

腐殖质作为常用的土壤改良剂，可以防止石油造成的土壤板结，改善微生物所处的生存环境。Kalantary等[20]实验发现，腐殖质可以抑制土壤与多环芳烃结合，使微生物更好地与多环芳烃接触，在腐殖质-多环芳烃条件下，微生物数量比土壤-多环芳烃条件下提高6倍，明显增加微生物对土壤中多环芳烃的利用度。一些石油污染土壤的修复也会使用有机废物来提高微生物的降解活性，Al-Kindi等[21]使用废蘑菇堆肥(SMC)，家禽粪便(PM)刺激微生物修复石油污染土壤，96 d后，添加SMC和PM的菌群呼吸活动产生的CO2从(8.7±1.9) mg CO2/g增加到(25.7±1.6)，(23.4±1.2)mg CO2/g，这也是一种有效的资源利用的方式。

植物本身就是微生物生长繁殖的天然培养基，一些植物的根系分泌物还会促进微生物对土壤中有机物的降解。Zhang等[22]研究了黄瓜根际细菌对氯嘧磺隆的降解作用。结果显示黄瓜根系的细菌含量达到2.14×105个/g，远高于周围环境的微生物数量，HPLC检测发现黄瓜根系分泌的5种有机酸，其中，柠檬酸和富马酸显著刺激了黄瓜根际上细菌的定殖，比单纯微生物修复的降解率高出18.4%。许超等[23]利用玉米和丛枝菌根真菌组合降解土壤中的芘，玉米根系分泌的琥珀酸和水杨酸为真菌提供共代谢底物，增强了微生物的活性和数量，提高了土壤中芘的降解效率。植物根系及其分泌物给微生物的新陈代谢提供最佳助力，配合外源营养物质会更大限度地提升微生物对石油烃的修复效率，这也是当下土壤修复的一个研究方向。

除以上常用的刺激物外，许多研究也利用其它的有机刺激物来促进微生物对石油烃的降解，表2为提高微生物降解效率的有机刺激物。

表2 提高微生物降解效率的有机刺激物

不同的有机刺激物质对微生物修复石油污染的促进作用各有不同。Peltola 等[32]利用投加尿素和亚甲基脲维持土壤氮含量，发现亚甲基脲更容易提高微生物对高浓度油的降解。尿素也会增高土壤氮含量，促进微生物的降解，但修复一段时间后，土壤pH>8.5。李援等[33 ]在实验过程中向土壤加入1.0 g/kg 的尿素时，总石油烃降解30 d后的降解率为51.6%，未加尿素的降解率为36.0%。由此可得尿素的添加适合短期土壤修复，长时间修复土壤会增大土壤pH，对土壤菌群造成危害。

许多表面活性剂可以很好地促进微生物的生长代谢，但促进效果存在差异。Patowary等[34]向污染土壤施用鼠李糖脂1.5 g/L，6个月后，测得微生物对石油烃(TPH)降解率达到86.1%，施用十二烷基硫酸钠(SDS)的生物降解率只达到68.1%，GC-MS分析鼠李糖脂处理的土壤消除了3种多环芳烃，即氟蒽、苯并芴和苯并蒽，而添加SDS的土壤中这几种物质依然存在，SDS只起到乳化原油的作用。Li 等[35]利用不同表面活性剂促进微生物修复石油污染土壤时，发现卵磷脂可以促使微生物产生生物电(0.321 C/(d·g))，提高石油降解菌对烃类的降解，而单硬脂酸甘油酯和十六烷基三甲基溴化铵对于促进石油烃降解效果不明显。十二烷基硫酸钠与β-环糊精对微生物具有选择富集性，可使梭菌丰度增加。花莉等[36]认为单纯使用微生物降解含油土壤的效率较低，仅为22.68%。分别添加Tween80、(鼠李糖脂)RL后，柴油土壤的修复效果达到46.11% 和45.32%。由此可以看出卵磷脂、RL、Tween80是目前较为好的微生物土壤修复助剂，以上其它几种表面活性剂对微生物降解石油污染物的促进作用较低。有机刺激物促进微生物修复的效果取决于微生物对营养物质的吸收和营养物质之间含量平衡，缺少或增加某些元素含量都会降低微生物的活性。单从营养元素对微生物影响来看，有机营养元素对微生物的促进作用大小也符合N>K>P>Cl>Na>Mg。

2.2 物理刺激对微生物修复含油土壤的影响 添加外源刺激物可以显著促进微生物的降解效果，辅助一些物理刺激方式会进一步提升修复效率。Guo等[37]实验发现微生物-电场联合修复石油污染土壤的效果较单纯微生物修复有明显提高，当电场强度在0.02 V/cm以下，修复效果随电场强度的增加而增加。王冰等[38]通过实验发现电动-微生物修复技术对胶质降解率是单纯微生物处理法的 3.06倍。经过50 d的修复，微生物量比单纯的生物修复提高了2个数量级。Luo 等[39]在探究指数生长期苯酚降解菌在不同直流电流下的细胞表面性质。发现20 mA的电流可以增加细胞表面疏水性并使细胞形状变平，有利于和有机物的接触，提高降解效果。因此，选择合适的电流能有效促进微生物体内电化学过程的进行，增强物质的摄取和分解，对于微生物降解含油污染物起到很好的辅助作用。

石油污染土壤修复过程中，土壤中的含氧量达到20～200 mg/L时，微生物可完全降解石油污染物。Thomé等[40]利用微生物-通风技术修复土壤中石油污染物，经过120 d，降解率达到85%。刘沙沙等[41]利用生物通风法修复柴油污染土壤，向土壤中通入空气时微生物的数量和活性比自然修复状态高。氧作为电子受体，可提高微生物体内的加氧酶对分子氧和能量的利用，加快细胞中营养物质的分解代谢。使用通风法加氧时，气流强度为2 L/min和最长气流间隔为每48 h通气1 h是最经济有效的。

3 多种方式联合刺激微生物修复原油污染实例

石油污染物进入土壤中，会降低微生物的酶促氧化作用。单一的生物刺激方法不能完全提高微生物的降解活性，通常使用多种刺激方式联合促进微生物的物质代谢，缩短微生物酶促氧化周期，达到高效修复的目的。Sun等[42]实验得出不同的刺激组合方法对促进微生物修复原油的效果不同：营养物质+植物+生物强化>营养物质+生物强化>植物+生物强化>仅加水。修复过程中使用营养物质的种类和刺激方式的多样性使微生物土壤修复变得简单易行，多数刺激物可以通过周围环境获得，降低现场修复的成本花费。表3为多种方式联合刺激微生物高效修复含油污染土壤的实例。

表3 多种方式联合刺激微生物修复含油污染土壤

以上不同实例由于实验环境(石油组分、土质、气候等)不同，导致研究结果之间存在差异，相比于无刺激修复，不同的刺激修复技术集中表现了对石油污染物土壤的高效修复作用，对于一些难降解的大分子物质，在生物刺激的作用下也能被高效的降解。

4 结论与展望

科学的设计方法是生物刺激有效性的保证，首先，确定所选微生物是否对土壤修复存在有效性，探究合适的外源刺激物质及合适的生存环境(温度、湿度、盐度、碱度、土质等)，在实验允许的最大条件下实践并改善，使微生物刺激修复技术能逐渐应用于深层土壤原位修复。未来关于如何刺激石油微生物来提高降解效率是一个值得研究的问题。今后可以从以下方面继续探究：

(1)深入研究刺激物在微生物降解石油烃过程中的作用机理，研制出作用于微生物降解石油烃反应的催化物质，改变石油烃在微生物体内的分解方式，加快降解效率。

(2)探究不同刺激物在微生物体内的相互作用机理，分析它们的作用方式，有针对性的组合刺激物质，最大限度提高微生物降解效率。

(3)利用科学手段改造植物或微生物，产生大量的营养分泌物，刺激石油微生物对污染物的高效修复，减少外源刺激物添加。

(4)设计新型处理工艺，将处理工艺与刺激技术相结合，使其能稳定高效地提升微生物活性，促进微生物高效降解石油污染。