张豪

（温州市中心医院，浙江 温州325000）

热休克蛋白90（HSP90）是一种分子伴侣，参与多种细胞功能和信号通路，并参与细胞的增殖、分化和凋亡[1]。有证据表明，HSP90的异常激活可促进癌症的发展，并与肿瘤的侵袭、远处转移和免疫逃逸等恶性发展过程有关[2]。据报道，抑制HSP90能增强抗癌药物诱导的侵袭性肿瘤细胞凋亡[3]。相关研究[4]为抑制HSP90作为肝细胞癌（HCC）的抗癌靶标提供了理论依据，但抑制HSP90与放射的联合作用尚不明确。NVP-AUY922（AUY922）属于间苯二酚异恶唑类似物，是HSP90有效的合成小分子抑制剂之一[4]。单一药物AUY922具有抗多种肿瘤（包括甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌等）的作用[5-6]。体外实验发现，AUY922具有放射增敏剂的作用[7]，本研究探讨 HSP90抑制剂AUY922对肝癌细胞系HepG2的放射增敏作用及机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 肝癌细胞系HepG2（中国科学院上海细胞库）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，美国 Gibco 公司）、AUY922（Novartis诺华公司）溶解于二甲基亚砜（DMSO，Sigma 公司）、Annexin VFITC、碘化丙啶（PI）细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）、流式细胞仪（美国BECK-COULTER公司）、酶标仪（美国 BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 肝癌细胞系HepG2于添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的 DMEM培养基37℃、5% CO2加湿的培养箱中孵育培养，以70%～80%的融合率传代培养，实验都在指数生长期的细胞中进行。细胞照射采用医科达直线加速器，射线能量为6MV，照射野面积20cm×20cm，源皮距100cm，剂量率为400cGy/min。将细胞分为对照组（DMSO 处理）、AUY922 组（IC20 浓度）、照射组（剂量照射6Gy）及AUY922+照射组（先用IC20浓度的AUY922处理24小时后用6Gy剂量照射）。

1.2.2 细胞毒性检测 文献[8]所述用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测AUY922对HepG2的细胞毒性，计算IC20（20%药物抑制浓度）。HepG2细胞经胰蛋白酶消化后接种于96孔板中，设置 1、5、10、50和100nM浓度梯度处理AUY922细胞，以仅加入培养液进行对照。作用48小时后，每孔加入10μL含CCK-8工作液的无血清培养基，5% CO2、37℃孵育1小时，用酶标仪测450nm处的吸光度值。细胞增殖抑制率=（1-药物组吸光度值／对照组吸光度值）×100%，以IC20时的药物浓度作为后续实验的药物作用浓度。

1.2.3 放射增敏检测 计数处于指数生长期的HepG2细胞，并铺在10cm的培养皿中培养24小时细胞贴壁后添加AUY922继续培养24小时，以0、2、4、6、8Gy 的剂量对照射细胞，24 小时后通过新鲜添加生长培养基除去药物，随后每7天补充1次。14天后甲醇／乙酸（3:1）固定，结晶紫染色，在倒置相显微镜下对克隆计数，克隆定义为包含至少50个细胞。集落形成率（PE）%=克隆数／接种细胞；细胞存活分数（SF）%=各照射剂量PE/未照射PE×100%，采用SPSS统计软件的多靶单击模型（SF=1-（1-e-D/D0）N）拟合细胞存活曲线，得出平均致死剂量（D0）、准阈剂量（Dq），计算放射增敏比（SER）=单纯照射的Dq值/对照加药的Dq值。

1.2.4 细胞凋亡检测和细胞周期分析 HepG2细胞以每孔3×105个细胞的密度接种在6孔板中，贴壁生长24小时后将细胞按上述四组处理。（1）分离细胞，在PBS溶液中重悬，离心去除上清液，加入FITC Annexin V（5μL 储备液/100μL 缓冲液）4℃避光孵育15分钟加入PI（100ng/100μL缓冲液）轻轻混匀，4℃避光孵育5分钟，流式细胞仪检测细胞的凋亡。（2）细胞经PBS重悬、70%预冷的无水乙醇5mL混匀并置4℃环境中固定24小时，离心取细胞，经PBS洗涤并打散细胞团后用20μg/mL RNase-A溶液在37℃避光温浴30分钟，去除RNA，加入10μg/mL PI在37℃下处理2小时。采用流式细胞仪分析细胞周期。

1.2.5 标记物γ-H2AX的检测 接种细胞在聚-L-赖氨酸（13.3 mg/mL）包被的的载玻片上，并在37°C，5% CO2温育24小时，4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定15分钟。用PBS洗涤后将细胞用0.5% Triton X-100透化10分钟。然后用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭30分钟，加入一抗 γ-H2AX（1∶250）4℃过夜，用 PBS 洗涤后与Alexa Flour 488 偶联的二抗（1:300，Molecular Probes）在室温下孵育1小时。将细胞在PBS中洗涤，盖玻片用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。 使用荧光共聚焦显微镜捕获荧光图像。

1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0统计学软件处理数据，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 细胞毒性作用 1、5、10、50、100nM 不同浓度AUY922作用于HepG2细胞48小时后的细胞抑制率分别为（5.61±1.45）%、（17.60±2.31）%、（27.36±3.56）%、（52.68±4.33）%、（69.00±4.23）%，提示抑制率呈药物浓度依赖性；IC50为 49.3nM，IC20为6.3nM，将6.3nM作为后续实验的药物浓度。

2.2 放射增敏作用 克隆存活曲线如图1所示，照射组和 AUY922+照射组 D0、Dq分别为 2.18、1.42和1.96、1.19，由Dq所得的SER为1.65。

图1 AUY922对肝癌细胞放射增敏结果

2.3 细胞凋亡和周期 与对照组相比，AUY922组和照射组细胞凋亡增加，而AUY922+照射组的凋亡细胞率较其他三组增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见图 2、表 1。与对照组相比，AUY922+照射组HepG2细胞在G2/M期表现出相对阻滞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见图3、表1。

表1 各组肝癌细胞凋亡率和细胞周期比较（±s）

表1 各组肝癌细胞凋亡率和细胞周期比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与AUY922+照射组比较#P＜0.05

细胞周期组别G 0/G 1 S G 2/M对照组 2.4 4±0.9 5 4 9.5 7±7.2 9 3 3.3 3±3.2 0 1 8.0 3±1.2 5 A U Y 9 2 2 组 1 5.4 1±2.2 1*#4 2.4 7±4.0 1 2 3.0 7±2.9 0 3 3.9 0±2.2 0*#照射组 1 1.9 2±2.3 6*#5 8.4 7±5.6 0 1 3.4 7±5.2 6 2 7.2 0±2.2 1*#A U Y 9 2 2+照射组 3 6.3 7±1.6 7*4 0.8 7±4.2 5 1 1.4 0±4.1 0 4 2.6 3±2.3 5*细胞凋亡率（%）

图2 各组肝癌细胞凋亡情况

图3 各组细胞周期

2.4 双链断裂修复DSB的标记物γ-H2AX 对照组和AUY922组的细胞显示出较低的DSB水平，与其他三组相比，AUY922+照射组细胞系在30分钟和24小时都显示出更高比例的γ-H2AX灶的细胞。详见图4。

图4 各组不同时间免疫荧光下观察γ-H2AX的形成

3 讨论

肝癌组织中HSP90的表达明显高于周围组织，表明HSP90的高表达可能参与了肝癌的发生过程，抑制HSP90可能是治疗肝细胞癌的一种有效策略[9]。多项研究表明，AUY922是有效的第三代HSP90抑制剂，在多种人类癌细胞中具有抗肿瘤活性。根据先前的报道，AUY922可以抑制各种类型肿瘤细胞的增殖，对肿瘤细胞具有毒性[4-5，10]，本研究显示，AUY922以浓度依赖的方式抑制HepG2细胞增殖。最近还证实了HSP90抑制剂对肺癌、胃癌和口咽鳞状细胞癌的放射增敏潜力[7，11]。本研究提示，使用HSP90抑制剂会降低HCC细胞系的克隆形成存活率，且对HCC细胞具有放射增敏作用。肝癌的一个重要特征是肿瘤可局部控制，如肝癌的放射治疗[12]。然而HCC对常规分次放射具有相对的抵抗性，且受到正常肝组织毒性的限制[13]。因此，选择性地增加肝癌细胞放射剂量是重要的研究领域。新一代HSP90抑制剂AUY922显示出较强的放射增敏活性。

细胞凋亡与消除潜在的恶性细胞、增生和肿瘤进展有密切联系。因此，促进细胞凋亡在抗癌作用中起着至关重要的作用。据报道，AUY922可诱导癌细胞凋亡[4]，本研究中HSP90抑制剂的治疗使细胞凋亡增加。为了进一步探讨AUY922诱导的放射致敏作用机制，本文观察其对细胞周期的治疗作用，结果表明，G2/M期细胞比例增加，与其他类型的癌症研究一致[11]，这些研究表明，仅用AUY922治疗即可导致癌细胞停滞在G2/M期，可能解释了本研究出现放射增敏作用的原因与AUY922诱导肝癌细胞进入放射更敏感的G2/M期阶段有关[11]，推测这些细胞可以表现出更高水平的辐射，诱发DNA损伤。DNA是放射治疗杀伤肿瘤细胞的主要靶标，放射治疗通过断裂DNA双链（DSB）发挥其抗癌作用，是最具毒性的DNA损伤之一，γ-H2AX是其主要的生物学标志物。本文采用免疫荧光观察γ-H2AX灶形成指示DSB，结果提示，HSP90抑制剂诱导的放射增敏作用机制可能包括抑制DSB。同样，Zaidi等[14]研究发现，HSP90抑制剂通过抑制DNA修复发挥放射增敏作用。

本研究证实HSP90抑制剂使肝癌细胞进入放射敏感性周期G/2M期并抑制其DNA修复，从而导致肝癌细胞系的强放射增敏作用，提示当HSP90抑制剂与放射治疗策略性结合时，可以为肝癌的治疗提供新的思路。