钟定福，胡丽瑜，陈丹，聂颖，张红英

（金华市人民医院，浙江 金华321000）

近年来，研究发现长链非编码RNA UCA1在多种肿瘤中表达异常，可作为肿瘤标记物或干预靶点[1]。UCA1在胃癌中异常表达且是临床预后的独立预测因子[2-3]，但具体机制尚不明确。有研究发现，UCA1可作为miR-204海绵吸附分子，通过竞争抑制miR-204重激活其靶基因，促进肿瘤细胞恶性增殖、转移等[4-6]。本文拟对UCA1调控miR-204在胃癌细胞增殖中的作用进行研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）胃癌组织。选择本院2016年6月-2019年6月经手术及病理确诊的10例胃癌组织标本及癌旁组织，患者术前均未行化疗或放疗。（2）胃癌细胞株。MNK-45及SGC-7901购于美国标准细胞培养库ATCC。细胞株贴壁培养于含10%胎牛血清（美国 GIBCO 公司， 货号：G10099141）、100U/mL 青霉素及 100μg/mL链霉素（美国 Hyclone公司，货号：SV30010）的DMEM培养液（美国Hyclone公司，货号：SH30022.01B）。 （3）脂质体转染试剂Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司，货号：L3000015）。 （4）CCK-8 细胞增殖试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，货号：40203ES76）。 （5）采用Trizol试剂（Invitrogen 公司，货号：15596-026）提取细胞总RNA，RNA逆转录cDNA及实时荧光定量PCR。（6）采用 TB Green®Premix TaqTMII（TliRNaseHPlus）（大连宝生物，货号：RR820A）进行基因表达测定。 （7）miR-204在细胞内的表达含量采用逆转录试剂盒TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems LifeTechnologies公司，货号：4366596），TaqManTMUniversalMasterMixII， withUNG （货号：4440044）及miR-204 探针（Assay ID：000508）和 U6 Taqman 探针（AssayID：000425）。 （8）一抗购自美国 CST 公司：Ki-67（货号：9449）、PCNA（货号：13110）、CyclinD1（货号：2978）、CyclinD2（货号：3741）、β-actin（货号：3700）。 （9）Luciferase荧光素报告系统采用双荧光素试剂盒（Promega公司，货号：E6110）。 （10）RIP 检测试剂盒（广州 BersinBio公司，货号：Bes5101）。

1.2 方法

1.2.1 分组 设立两个转染组分析UCA1的生物学活性，分别为siRNA对照组和siUCA1敲减组，即转染UCA1干扰siRNA，选择敲减效率较高者进行后续敲减实验。设立4组转染组观察UCA1对miR-204活性的影响：（1）对照组：阴性miRNA模拟物对照+空载 pcDNA3.1 载体；（2）miR-204 过表达组：miR-204模拟物 （mimics）+空载 pcDNA3.1 载体；（3）UCA1 过表达组：UCA1过表达载体+阴性miRNA模拟物对照；（4）联合组：miR-204mimics+UCA1 过表达载体。

1.2.2 miRNA 模拟物（mimics）、siRNA、过表达载体构建及转染 miR-204 mimics及对照mimics、UCA1 siRNA（siUCA1-1，siUCA1-2 及对照 siRNA）均由上海吉玛基因有限公司提供，其中UCA1的2条 siRNA靶序列分别为：siUCA1-1：GCCATATGAAGACACCCTA 和 siUCA1-2：TTAATCCAGGAGACAAAGA。UCA1及CCND2的cDNA合成及克隆至pcDNA3.1（+）中，将野生型及突变型CCND2的3’UTR克隆至psiCHECK-2荧光素报告质粒中，均由上海吉玛基因有限公司提供。脂质体转染按厂商说明书进行。

1.2.3 CCK-8细胞增殖试验 按1.2.1中siUCA1敲减组和siRNA对照组两组胃癌细胞，miR-204过表达组、UCA1过表达组、联合组以及对照组4组细胞进行CCK-8细胞增殖活性比较。胃癌细胞经胰蛋白酶消化后以1×104细胞接种96孔板，加入CCK-8溶液（10μL/孔）继续培养4小时。通过酶标仪测量该样品在450nm处的吸光光度值。

1.2.4 RNA提取、逆转录及实时荧光定量 PCR采用Trizol试剂提取胃癌组织及1.2.1中分组细胞总RNA，对于UCA1及CCND2基因表达，RNA逆转录cDNA及实时荧光定量PCR采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）进行。 UCA1 上游引物为 5′-TTACCTGGGGAACCCCGACC-3′，下游引物为 5′-TGGTGAAGGATGAGGGCTCGT-3′。CCND2上游引物为 5′-GTG CTGGGGAAGTTGAAGTG-3′， 下游引物为 5′-GGC AAACTTAAAGTCGGTGG-3′。内参基因GAPDH上游引物为5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’， 下游引物为 5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’。扩增反应条件均为 95℃，5 分钟；95℃，30 秒，60℃，34 秒，35 个循环；72℃，5分钟；反应总体积20μL，其中cDNA 2μL，2×反应液 10μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL。 miR-204在细胞内的表达含量采用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit，TaqManTMUniversal Master Mix II，with UNG 及miR-204探针和内参基因U6 Taqman探针，操作步骤按说明进行。相对表达量采用2-△△Ct公式计算，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）胃癌组织或处理组细胞-（Ct目的基因-Ct内参基因）癌旁组织或对照细胞。

1.2.5 Western blotting试验 收集1.2.1中各分组细胞，抽提总蛋白，利用BCA法测定总蛋白浓度，以每个泳道20μg的蛋白样品上样，经10%变性SDS PAGE电泳后利用电转化法将蛋白转移至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉室温封闭2小时，加入一抗（Ki-67、PCNA、CyclinD1、CyclinD2、β-actin），4℃孵育过夜；次日二抗37℃孵育1小时；TBS-T洗膜3次，每次10分钟，ECL发光试剂显影。以GAPDH为内参进行比较。

1.2.6 Luciferase荧光素报告系统 胃癌细胞以每孔1×105细胞接种于6孔板中，次日转染野生型或突变型CCND2-3′UTR的psiCHECK-2报告载体以及miR-204 mimics。培养48小时后通过双荧光素试剂盒检测荧光素活性。以对照组为100%计算各处理组的相对荧光素强度。

1.2.7 RNA免疫沉淀（RIP）实验 采用RIP检测试剂盒分析UCA1、miR-204与Ago2蛋白的结合情况。鉴于RIP实验过程中存在非特异性吸附的干扰背景，利用IgG为阴性对照抗体，并将Ago2富集的UCA1及miR-204信号与IgG富集信号进行比较。Input RNA为未用抗体沉淀的细胞总RNA量。实验步骤按试剂盒说明书进行，利用上述1.2.4方法检测UCA1及miR-204相对表达量。

1.3 观察指标 荧光定量PCR检测胃癌组织及癌旁健康组织中UCA1及miR-204相对表达。Western blotting试验检测siUCA1敲减组及siRNA对照组细胞增殖标记物Ki-67、PCNA、CyclinD1及CyclinD2的相对表达情况。Luciferase荧光素报告系统检测野生型或突变型CCND2-3′UTR报告系统荧光素活性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计学分析。细胞实验结果为正态分布的计量资料用（±s）描述，采用 t检验。

2 结果

2.1 UCA1的表达 设癌旁正常组织中UCA1的表达倍数为1，荧光定量PCR检测UCA1在胃癌组织及癌旁健康对照组织中的表达，UCA1在胃癌组织中相对癌旁对照组织的表达倍数为（2.779±2.218）（t=2.537，P＜0.05）。

2.2 UCA1对胃癌细胞的增殖作用 在UCA1的2条siRNA筛选中，siUCA1-1敲减效率高于siUCA1-2，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表 1、图1，选择siUCA1-1作为后续敲减实验。CCK-8增殖实验发现，UCA1敲减后MNK-45及SGC-7901细胞增殖活性与对照组细胞相比减低，差异有统计学意义（P＜0.01），详见表 2、图 1。 Western blotting检测发现细胞增殖标记物Ki-67、PCNA及Cyclin D1表达在各处理组细胞中均显著下调（图1）。

表1 UCA1 敲减率（±s）

表1 UCA1 敲减率（±s）

与siUCA-1-2组比较*P＜0.05

组别 MNK-45（%） SGC-7901（%）siUCA-1-1 69.67±5.51* 58.67±3.51*siUCA-1-2 23.33±9.61 10.00±5.00

表2 UCA1敲减后MNK-45及SGC-7901细胞增殖活性变化（OD450nm吸光度）（±s）

表2 UCA1敲减后MNK-45及SGC-7901细胞增殖活性变化（OD450nm吸光度）（±s）

与siRNA对照组比较**P＜0.01

S G C-7 9 0 1第1天 第2天 第3天 第4天 第1天 第2天 第3天 第4天s i R N A 对照组 0.2 0 6 7±0.0 2 9 8 0.3 6 8 0±0.0 1 6 6 0.7 4 9 5±0.0 4 6 3 1.2 4 5 0±0.1 2 0 8 0.2 1 1 8±0.0 2 2 7 0.4 0 0 3±0.0 3 4 5 0.8 1 7 5±0.0 9 3 3 1.4 6 5 0±0.1 0 3 0 U C A 1 敲减组 0.2 1 8 2±0.0 2 7 7 3 0.3 2 0 4±0.0 1 9 9**0.5 3 4 5±0.0 6 5 1**0.7 4 7 7±0.0 8 2 7**0.2 0 4 4±0.0 1 7 5 0.3 2 1 7±0.0 7 2 2**0.5 5 8 5±0.0 8 7 9**0.9 0 7 2±0.1 3 8 1**M N K-4 5组别

图1 减低UCA1表达对胃癌细胞增殖活性的影响。1A：siUCA1-1 vs siUCA1-2，**P＜0.01敲减效率；1B：CCK-8检测UCA1 敲减组与对照组（NC）细胞增殖活性（siUCA1-1vs NC，**P＜0.01，n=6）；1C：Western blotting 检测细胞增殖标记物Ki-67、PCNA及Cyclin D1的表达情况。

2.3 UCA1对miR-204的作用 在MNK-45及SGC-7901细胞中转染siUCA1后，miR-204较对照细胞相对表达倍数分别为（4.60±0.45）（t=13.61，P＜0.01）、（4.57±0.25）（t=24.55，P＜0.01）。CCK-8 增殖试验表明，miR-204过表达组增殖活性弱于对照组（P＜0.01）；而UCA1过表达组细胞增殖活性强于对照组（P＜0.01）；差异均有统计学意义。当miR-204与UCA1联合共转染时，联合组细胞增殖活性强于单纯miR-204过表达组，差异有统计学意义（P＜0.01）。 详见表 3。

表3 UCA1及miR-204表达改变后细胞增殖活性变化（OD450nm 吸光度）（±s）

表3 UCA1及miR-204表达改变后细胞增殖活性变化（OD450nm 吸光度）（±s）

与对照组比较**P＜0.01；与miR-204过表达组比较△△P＜0.01

组别 MNK-45 SGC-7901对照组 0.7405±0.0333 0.8577±0.0461 miR-204 过表达组 0.4480±0.0454** 0.5475±0.0439**UCA1 过表达组 1.322±0.1273** 1.469±0.1291**联合组 1.029±0.1758△ 1.062±0.1221**△△

2.4 RIP试验 Ago2在胃癌细胞MNK-45和SGC-7901细胞中结合UCA1和miR-204相对含量高于IgG免疫沉淀组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。 详见表 4。

表4 细胞株MNK-45和SGC-7901中Ago2结合UCA1及miR-204的相对富集含量（±s）

表4 细胞株MNK-45和SGC-7901中Ago2结合UCA1及miR-204的相对富集含量（±s）

与IgG免疫沉淀组比较**P＜0.01

组别M N K-4 5 S G C-7 9 0 1 U C A 1 m i R-2 0 4 U C A 1 m i R-2 0 4 I g G 免疫沉淀组 1.5 3 3±0.2 5 1 7 2.4 0 0±0.4 5 8 3 1.1 6 7±0.3 5 1 2 2.7 3 3±0.3 2 1 5 A g o 2 免疫沉淀组 8.4 3 3±0.9 5 0 4** 6.9 3 3±0.5 1 3 2** 8.3 3 3±1.0 6 9** 7.6 3 3±0.4 1 6 3**

2.5 miR-204抑癌作用的路径 利用Targetscan软件发现，CCND2的3’UTR存在miR-204潜在结合位点（图3A）。miR-204过表达组细胞CCND2的mRNA转录水平（图3B）和蛋白水平显著下调（图3C）。将含有野生型及突变型miR-204结合位点的CCND2-3’UTR克隆至psiCHECK2荧光素报告载体中，并转染入胃癌细胞中。结果发现，miR-204过表达组细胞野生型CCND2-3’UTR荧光素活性低于对照组细胞，差异有统计学意义（P＜0.01），而miR-204过表达组细胞中突变型荧光素活性与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）（图3D），表明miR-204可以体外结合并抑制CCND2的转录表达。

图2 Ago2结合UCA1及miR-204的相对富集含量

图3 miR-204在胃癌细胞中靶向调控CCND2。3A：野生型或突变型CCND2-3’UTR结合序列示意图；3B：CCND2的mRNA 表达变化（miR-204 过表达组 vs对照组，**P＜0.01，n=3）；3C：CCND2 的蛋白表达变化；3D：野生型或突变型荧光素报告载体的荧光强度变化（转染组细胞vs对照细胞，**P＜0.01，n=3）。

2.6 UCA1过表达对miR-204调控CCND2的影响miR-204过表达组CCND2表达显著低于对照组（t=10.92，P＜0.01），为对照组的（0.5267±0.0751）倍。UCA1过表达组CCND2表达显著高于对照组（t=7.894，P＜0.01），为对照组（2.253±0.2750）倍。 UCA1 和 miR-204 mimics联合处理细胞后，CCND2的表达变化为对照组的（1.220±0.2352）倍（t=1.620，P＞0.05）。

3 讨论

尽管长链非编码RNA最初被认为是 “转录噪音”，越来越多的证据表明，lncRNA在染色质重塑、细胞增殖与凋亡、细胞分化等细胞生物学过程中起到了重要作用[7-8]。近年来发现，长链非编码RNA UCA1在胃癌的发生、发展中起重要作用。UCA1不仅在胃癌组织中异常表达，其表达水平与预后呈正相关，且UCA1对胃癌细胞增殖凋亡、转移和侵袭等生物学行为也起到了促进作用[9-12]。本研究发现，UCA1在胃癌中可以通过抑制miR-204活性、上调miR-204靶基因CCND2来促进胃癌细胞增殖，为UCA1介导的致病机制提供了新的实验室证据。

Cyclin D蛋白属于细胞周期素（Cyclin D），在G1中晚期表达最高，而在S期表达最低，提示其表达增高与细胞增殖有着密切关系。Cyclin D蛋白有3 种亚型：Cyclin D1（CCND1），Cyclin D2（CCND2），Cyclin D3（CCND3），分布在不同染色体中，但具有独特的Cyclin box和PEST序列[13]。CCND1为目前报道最为广泛的细胞周期素。研究发现，Cyclin D1在多种肿瘤中有DNA扩增现象，已作为肿瘤增殖标记物或干预靶点[14-15]。CCND2在肿瘤中也存在表达上调，但与CCND1不同，CCND2并未发现其过表达与DNA扩增有关，提示其表达可能与其他调控机制有关[16-17]。本研究发现，在胃癌中UCA1可通过抑制miR-204对CCND2表达进行调控，从转录水平上揭示CCND2表达调控异常的一种分子机制。CCND2在胃癌中表达上调，高水平CCND2与胃癌患者总体生存率呈负相关[18]。本研究同时发现，在胃癌MNK-45中过表达CCND2可显著增加细胞增殖活性水平，同时也提示UCA1促胃癌增殖功能可能一部分是通过调控CCND2实现的。

长链非编码RNA作为miRNA的竞争RNA（ceRNA）被广泛报道。本研究发现，UCA1可以作为miR-204的海绵吸附竞争分子，重激活CCND2表达。在胃癌细胞中敲减UCA1后，miR-204表达升高；提高miR-204水平后，显著抑制胃癌细胞MNK-45及SGC-7901的生物学活性，而同时过表达UCA1，细胞增殖活性与对照组无显著差异，表明miR-204的抑制活性被中和，UCA1对miR-204活性有抑制作用。分子水平上，胃癌细胞中敲减UCA1后miR-204表达升高。同时，RIP实验发现，Ago2蛋白可显著富集UCA1及miR-204。Ago2为长链非编码RNA海绵吸附miRNA，并调控其活性的主要蛋白。上述结果提示，UCA1可能与miR-204直接结合Ago2蛋白，并通过Ago2蛋白抑制miR-204活性。CCND2荧光素报告系统发现，CCND2为miR-204调控靶基因，而在胃癌细胞中过表达UCA1可以上调CCND2表达水平。结合UCA1对miR-204抑制作用的数据推测，UCA1极有可能通过海绵吸附作用来抑制miR-204，而活化CCND2表达。

综上所述，UCA1具有促胃癌细胞增殖的功能，其促进作用与抑制miR-204并上调其靶基因CCND2表达有关。本研究丰富了长链非编码RNA UCA1在胃癌发生、发展中的作用机制，为胃癌精准干预提供了潜在靶点。