孙华林,田奎蓉,洪 业,吴梦丹,陈轶霞,刘俊林

(西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030)

高血压是以动脉血压超过临界血压值并持续升高为主要特征的综合病症,同时伴有肝、心、肾等多个组织器官结构、功能改变,影响局部微循环,导致代谢失衡的慢性疾病[1]。经大量临床病征和生理学研究,高血压发病机制受复杂的通路调节,并且受一系列外环境影响[2-4],尤以自由基代谢失衡、血液脂质代谢紊乱和水盐调节异常等因素为主要表现[5-8]。同时长期高血压会过度激活“肾素-血管紧张素-醛固酮系统”(RAAS)而引起心脏组织肥大导致心脏衰竭,因此,调整机体的RAAS水平、改善机体血脂代谢紊乱与调节水盐代谢异常是治疗高血压的关键[9]。

芹菜(ApiumgraveolensL.)属伞形花科蔬菜,植株中含有丰富的黄酮类化合物,以芹菜素含量最高,芹菜素(apigenin)又称芹黄素,是天然存在的一种黄酮类化合物,其独特的生理学效应和生物学特性来源于黄酮结构所含的三个-OH与C2=C2基团[10]。其具有降压安神、降血脂、保护心血管和增强免疫力等功效[11-12],何芳等[13]研究发现芹菜素能降低高脂高盐所致高血压大鼠血压并有保护心脏的作用,可能与芹菜素能够有效降低高脂高盐所致高血压大鼠AngII水平、降低血脂、改善抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤有关。

本研究主要探讨芹菜不同部位提取物与芹菜素作用于高盐高血压大鼠模型,分析比较芹菜各部位提取物与芹菜素对改善高盐所致大鼠高血压与血脂代谢紊乱的效果与其机制进行探究,并分析二者对高血压的作用关系,以期为筛选芹菜药食同源食用最佳部位及其作为天然产物作用于临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物:200～250 g Wister大鼠90只雌雄各半 购于中国农业科学院兰州兽医研究所(实验动物许可证号:SYXK(甘)2015-0001)实验大鼠饲养、实验和处死均遵照实验动物管理条例和福利伦理指南执行;兰州本地毛芹(Apiumgraveolens) 全株经西北民族大学刘俊林副教授鉴定为毛芹;TG试剂盒、HDL-C试剂盒、LDL-C试剂盒、CHOL试剂盒 均购自南京建成生物有限公司;碘[125Ⅰ]血管紧张素Ⅰ放射免疫分析药盒、碘[125Ⅰ]血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒碘[125Ⅰ]、醛固酮放射免疫分析药盒、碘[125Ⅰ]肾素活性放射免疫分析药盒 均购自北京北方生物技术研究有限公司;芹菜素(95%) 购自上海纯优生物科技有限公司;给药对照药物“卡托普利” 常州制药厂有限公司;乙腈(色谱级) 南京化学试剂股份有限公司;其余药品均为国产分析纯。

Beckman Coulter AU680全自动生化分析仪、Beckmanγ计数器 美国Beckman公司;XH6020全自动放射免疫计数仪 中国同辐股份有限公司;N-1100D旋转蒸发器 上海安亭科学仪器厂;UV-1800紫外分光光度计、HPLC-SPD 15C高效液相色谱仪、UV CBM-20A数据处理系统 日本岛津公司;Biotek多功能酶标仪 北京诺亚威仪器仪表有限公司;FD-1C-50真空冷冻干燥仪 北京博医康实验仪器有限公司;3K30超速低温离心机 Sigma公司;SL-N精密电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;KW-I恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂;Nikoncoolpix 4500数码照相机 日本尼康公司;ML-1.8-4可调式电热板 北京科伟永兴仪器有限公司;LEICA-DM500光学显微镜 德国莱卡公司;MICROM HMS70自动染色仪 德国MICROM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芹菜各部位提取物的制备 将毛芹洗净后分离根、茎、叶切碎置于80 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重,充分研磨粉碎,70 ℃、70%乙醇浸提2 h,60目筛过滤后收集滤液,重复三次,合并样液[10],转入真空冷冻干燥器(-60 ℃),干燥至恒重,分别得到芹菜根提取物、芹菜茎提取物与芹菜叶提取物。

1.2.2 芹菜素含量的测定 采用HPLC法进行测定:色谱柱:WondaSilC18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(35∶65,V/V);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;UV检测,检测波长:270 nm[14]。以纵坐标y为吸收峰,横坐标x为浓度建立回归方程:y=539223x-356988;R2=0.996。

1.2.3 大鼠高血压模型的建立及治疗过程 对实验组和模型组饲喂高盐大鼠饲料和饮用0.6%氯化钠液,持续6周[15],待其动脉血压超过150 mmHg并保持稳定时确立模型建立。模型建立后取72只建模成功大鼠均分为6组,每组12只。取1.2.1中提取所得芹菜叶、茎、根物质按3.0 g/kg·BW(芹菜素含量分别为27.34、21.77、17.67 mg/g)对芹菜根组、芹菜叶组、芹菜茎组进行给药。芹菜素组给予0.11 g/kg·BW芹菜素,给药对照组给予卡托普利(0.042 mg/kg·BW),以健康大鼠作为正常组,模型组与空白组给予等量正常饮用水,持续治疗4周。

1.2.4 大鼠体重变化 治疗期间每周对各组大鼠进行称重,观察大鼠体质量改变情况。

1.2.5 大鼠“RAAS系统”含量变化测定 治疗结束后,皮下注射戊巴比妥麻醉固定,颈侧动脉采血,2500 r/min,4 ℃离心10 min后吸取血清,按照各试剂盒要求添加抗凝剂与碘标记物测定血清中血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)的含量以及肾素活性(PRA)。

1.2.6 大鼠血浆中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量测定 采用颈侧动脉采血方法分别取各组大鼠静脉血,按照TG、HDL-C、LDL-C、CHOL试剂盒流程,进行含量测定,各试剂盒测定标准方程相关系数r均≥0.995。

1.2.7 大鼠心脏系数(CWI)和心肌增值系数(MPI)的测定 给药治疗4周后,称量各组大鼠体质量,颈椎脱臼处死后快速摘除心脏并称重,沿二尖瓣剥离左心室称重,计算CWI和MPI[16]。

1.2.8 大鼠心脏组织切片观察 取各组大鼠左心室组织4%甲醛浸泡完全,进行石蜡组织切片及HE染色等操作[17],观察各组大鼠心脏病变情况。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 芹菜素标准品及芹菜各部位提取物HPLC图谱

根据GB/T 19427-2003[14]方法测定所得:芹菜各部位提取物中存在多个吸收峰,如图1所示,除了在3.425 min处有芹菜素明显特征吸收峰以外,4.207、6.0142、6.554 min处还存在三个较高吸收峰,考虑是芹菜(叶、茎、根)各部位提取物存在多种黄酮类物质,三个峰总面积分别占芹菜各部位总提取物的26.420%、76.799%、21.694%,可见兰州毛芹中非芹菜素特征黄酮物质含量非常丰富,其潜在研究价值较高。

图1 95%芹菜素及芹菜各部位提取物HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of 95% apigenin and extracts from different parts of celery注:A:芹菜素标准品 B:芹菜各部位提取物(a:芹菜叶提取物;b:芹菜茎提取物;c:芹菜根提取物)。

2.2 芹菜不同部位提取物对大鼠动脉血压变化的影响

如表1所示,第0周时模型组、实验组(芹菜根组、芹菜茎组、芹菜叶组)与给药对照组大鼠动脉血压均高于正常组大鼠血压,且均超过150 mmHg,即说明模型建立成功。经治疗后第4周时,芹菜叶组、芹菜素组与给药对照组大鼠动脉血压与模型组相比有极显著降低(P<0.01);芹菜茎组大鼠动脉血压与模型组相比显著降低(P<0.05);芹菜根组大鼠血压治疗前后改变并不显著(P>0.05);模型组大鼠动脉血压随时间延长呈增加趋势,正常组大鼠动脉血压并未增高。芹菜各部位提取物对高盐所致大鼠高血压均有一定的降压作用,以芹菜叶组提取物与芹菜素降压作用效果最为明显;芹菜叶提取物组与芹菜素组两组降压效果相近,可能与芹菜叶中含有大量芹菜素有关。

表1 大鼠动脉血压变化Table 1 Changes in arterial blood pressure in rats

2.3 大鼠体质量变化

如图2所示,模型组大鼠体质量随治疗时间增加而呈现降低趋势,实验组大鼠体重有小幅波动,但随治疗时间延长均呈现增长的趋势。

图2 大鼠体质量变化Fig.2 Changes in rat body mass

2.4 芹菜不同部位提取物对大鼠“RAAS系统”含量变化影响

如表2所示,模型组血浆中AngⅠ含量与正常组相比有极显著降低(P<0.01),AngⅡ含量与正常组相比有极显著性增高(P<0.01);芹菜根组血清中AngⅠ含量与正常组相比具有显著性降低(P<0.05);芹菜根组、芹菜茎组、芹菜叶组、芹菜素组大鼠血浆中AngⅠ含量与模型组相比有极显著增高(P<0.01),芹菜根组与芹菜茎组血浆中AngⅡ含量与正常组相比具有极显著性增高(P<0.01);芹菜茎组、芹菜叶组、芹菜素组大鼠血浆中AngⅡ含量与模型组相比有极显著降低(P<0.01),芹菜根组大鼠血浆中AngⅡ含量与模型组相比有显著降低(P<0.05),并且芹菜叶组与芹菜素组降低最为明显。AngⅡ能使全身小动脉收缩而升高血压,具有很强收缩血管的能力[18]。可见,芹菜各部位提取物能有效降低血液中AngⅡ的含量,从而达到减弱血管收缩,降低血压。

表2 大鼠血浆中AngⅠ、AngⅡ含量Table 2 Contents of AngI and AngII in rat plasma

如表3所示,模型组血浆中PRA与正常组相比具有极显著性增高(P<0.01);芹菜根组和芹菜茎组血浆中PRA与正常组相比具有显著性增高(P<0.05);各组ALD与模型组相比均无较大改变,不具备统计学意义,芹菜叶组、芹菜素组、给药对照组与正常组大鼠血浆中PRA与模型组相比有显著降低(P<0.01),芹菜根组与芹菜茎组大鼠血浆PRA与模型组相比有显著降低(P<0.05)。隋海霞等[19]研究发现芹菜素作用下能降低大鼠血浆中ALD,本实验中芹菜各部位提取物作用下能降低大鼠血浆中ALD的含量与PAR活性,从而减弱血管收缩,降低血压,而芹菜各部位提取物作用效果有所差异,可能与各部位提取物中所含芹菜素含量不同有关。

表3 大鼠血浆中ALD含量与 PRA Table 3 ALD content and PRA activity in rat plasma

2.5 芹菜不同部位提取物对大鼠血浆中TG、HDL-C、LDL-C、CHOL的含量变化影响

如表4所示,模型组大鼠血浆中HDL-C、LDL-C 与TG含量与正常组相比具有极显著性差异(P<0.01);芹菜素组大鼠血浆中HDL-C含量与模型组相比有极显著增高(P<0.01),芹菜叶组与给药对照组大鼠血浆中HDL-C含量与模型组相比显著增高(P<0.05);芹菜茎组、芹菜素组、给药对照组与正常组大鼠血浆中LDL-C含量与模型组相比有极显著降低(P<0.01),芹菜根组、芹菜叶组大鼠血浆中LDL-C含量与模型组相比显著降低(P<0.05);芹菜根组和芹菜茎组大鼠血浆中TG含量与正常组相比有极显著性增高(P<0.01);芹菜素组、给药对照组大鼠血浆中TG含量与模型组有显著性降低(P<0.01),芹菜叶组大鼠血浆中TG含量与模型组相比显著降低(P<0.05)。芹菜各部位提取物作用下,能升高大鼠血浆中HDL-C含量,降低血清中LDL-C与TG含量,有效改善高盐大鼠高血压脂代谢紊乱情况[20]。

表4 大鼠血浆中TG、HDL-C、LDL-C的含量Table 4 Contents of HDL-C,LDL-C,and TG in rat plasma

如图3所示,模型组与芹菜根组血浆中CHOL含量与正常组相比有极显著性降低(P<0.01);芹菜茎组与芹菜叶组血清中CHOL含量与正常组相比有显著性降低(P<0.05);芹菜素组、给药对照组血清中CHOL含量与模型组相比有极显著性增高(P<0.01);芹菜根组、芹菜茎组、芹菜叶组、芹菜素组大鼠血浆中CHOL较模型组均有增高但与模型组相比并无显著性差异(P>0.05)。

图3 血浆中CHOL含量Fig.3 CHOL content in plasma

2.6 芹菜不同部位提取物对大鼠心脏系数(CWI)和心肌增值系数(MPI)的影响

如表5所示,与正常组相比,模型组CWI与MPI均有所升高,但无显著性差异。与模型组相比,各组CWI与MPI均无显著性差异,其中,芹菜茎组、芹菜叶组、芹菜素组CWI与模型组相比均有所降低,并且芹菜茎组、芹菜叶组、芹菜素组CWI降低程度基本一致,芹菜根组、芹菜叶组、芹菜素组MPI与模型组相比较低,芹菜素组降低最为明显。芹菜素作用下能有效降低大鼠CWI与 MPI[21],在芹菜各部位提取物作用下,表现出能降低大鼠CWI与MPI,减弱因血压升高而导致的心脏肥大和心肌增生,具有保护心脏的作用。各提取物作用能力各异可能与芹菜各部位所含芹菜素含量与黄酮类物质种类有所相关。

表5 大鼠心脏系数(CWI)和心肌增值系数(MPI)Table 5 Rat heart coefficient(CWI)and myocardial value-added coefficient(MPI)

2.7 大鼠心脏切片观察

图4a与图4g相比:心肌细胞水肿心肌纤维间隙增宽,部分心肌纤维断裂并伴有红细胞浸润,心肌细胞核有发生核溶解、核碎裂情况,心肌周围有炎性细胞浸润。芹菜根提取物作用下对高盐高血压大鼠心脏病变情况改善效果并不显著,但能减少心肌纤维内出血与心肌纤维断裂情况;图4b与图4g相比:心肌细胞水肿,心肌纤维间隙有所增宽,心肌纤维断裂情况不明显,仍有部分红细胞充斥于心肌纤维内部,心肌细胞核有部分溶解、碎裂。芹菜茎提取物作用下能有效减少高盐高血压大鼠心肌纤维断裂和心肌纤维内出血情况,同时减少心肌细胞坏死情况;图4c与图4e相比:心肌细胞水肿消退,心肌纤维无断裂情况,纤维内部无红细胞浸润现象,细胞核完整,有轻微炎性细胞浸润。芹菜叶提取物作用下能有效改善高盐高血压大鼠心肌病变情况,除心肌纤维间有轻微炎性细胞浸润外,病变情况基本消失;图4d与图4e相比:心肌细胞水肿消退,心肌纤维完整,心肌细胞无变性坏死现象,纤维内部无红细胞浸润现象,细胞核完整;芹菜素作用下,高盐高血压大鼠心肌基本无病变情况出现;图4e与图4g相比:心肌细胞水肿,心肌纤维致密,心肌纤维内有大量出血形成血肿,心肌纤维断裂严重,心肌中充满炎性细胞,心肌细胞变性坏死严重。高盐高血压大鼠心肌病变严重,同时有大量心肌增生与大量出血,与血压不断升高和血脂代谢紊乱有关;图4f与图4e相比:心肌细胞水肿消退,心肌纤维有轻微断裂情况,伴随轻微炎性细胞浸润,无出血现象;图4g心肌细胞正常,心肌纤维完整,无出血现象和炎性细胞浸润情况。

图4 大鼠心脏切片结果Fig.4 Rat heart section results注:a～g图分别为芹菜根治疗组、芹菜茎治疗组、芹菜叶组大鼠、芹菜素组、模型组、给药对照组、正常组大鼠心脏左心室切片(200×)。

3 讨论与结论

高盐性高血压是指在长期摄入高盐高脂类物质后引发机体脂质和水盐代谢紊乱,引起“肾素-血管紧张素-醛固酮系统”(RAAS)过度激活,AngⅠ向AngⅡ快速转化,导致血浆AngII水平显著升高[22-23],引起血管持续收缩造成血压升高;同时引起血浆中HDL-C降低,TG、LDL-C、CHOL水平升高,血压持续上升造成心肌过度拉伸、心脏负荷过重引起导致心肌肥大,并可导致心衰,心肌纤维过度拉伸甚至断裂,心肌内伴随持续出血和炎性细胞浸润的情况[22-25],最终高血压合并高血脂,造成机体器官负担过重引发诸多并发症如糖尿病、肾病等的一种疾病[26]。因此抑制“RAAS系统”过度激活,降低血浆AngⅡ水平,改善因血脂代谢紊乱所致心脏组织器官病变、坏死是治疗高血压的关键因素。

本研究采用高盐饲料饮水饲喂大鼠进行高盐性高血压大鼠造模,考察了芹菜不同部位提取物对高盐高血压大鼠降压效果并对其机制进行探究,实验结果显示:芹菜不同部位提取物与芹菜素能有效降低肾素活性(PRA),降低血浆中AngⅡ含量,对“RAAS系统”过度激活具有明显的抑制作用,能够达到降低动脉血压的效果;芹菜不同提取物作用下与模型组相比能够改善大鼠血脂代谢异常的情况,有效升高血浆HDL-C水平,降低LDL-C、TG与CHOL,表现出能降低CWI与MPI减轻大鼠因心脏肿胀而造成的大鼠心负担过重,减轻心肌细胞水肿,减少心肌纤维断裂,维持心肌细胞细胞核完整的能力。结合检测结果与组织切片观察综合分析可见芹菜叶、茎提取物对大鼠高血压具有良好的治疗作用。同时,改善血脂异常情况有助于降低高血压,能缓解由于高血压引起的心脏等组织器官过负情况,对局部循环具有调节作用。芹菜食疗药用价值显著,兰州毛芹各部位提取物种中非芹菜素特征图谱黄酮物质含量颇丰,相关生物活性机制具有较高潜在研究价值,其特征类物质对降脂降压通路机制有待进一步研究。