王政纲,赵丽华,王德宝,靳 烨

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

冰温贮藏保鲜技术是一种将生鲜食品放置于0 ℃以下、冰点温度以上的一种冷藏方式。冰温贮藏可以让食品维持在最低的生理活性的水平,且不易产生冻害,以达到长期保鲜的效果[1]。冰温贮藏羊肉在(-1 ℃)贮藏条件下保质期能达到30 d以上。冰鲜羊肉作为一种新贮藏方式,所有影响肌肉成熟进程的因素,都会影响冰鲜羊肉成熟进程。羊屠宰之后要经历僵直迟滞期、僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期,由于冰温贮藏周期长、贮藏温度波动、个体部位差异等因素成熟周期持续0～10 d[2],所以需要准确评价羊肉宰后僵直及成熟进程的指标与方法,目前常用的指标有测定肌肉的pH、剪切力、肌原纤维小片化指数(Myofibrillar fragmentation index,MFI)、保水性等,但指标需要综合运用,才能对宰后肌肉成熟进程进行正确判断,况且指标测定操作复杂、耗时长,不能到达对羊肉成熟过程实现在线、准确、实时监测。

在交流电电路中,介质阻碍电流通过的能力称为电阻抗(electrical impedance spectroscopy,EIS)[3]。电阻抗能够快速反映肌肉组织内部结构、生理生化特性,且设备使用方便,检测结果快速,一直是人们研究的热点,其在肉制品中的应用也在不断扩展[4]。目前,电阻抗技术已被应用于评估肉中脂肪的含量、测定肉 pH的变化、监测肌肉失水量、异常PSE肉(Pale Soft Exudative)和DFD肉(Dark Firm and Dry)的识别、控制肉的成熟度、冻肉与非冻肉的区别等方面[5-6]。

模糊综合评判法(Fuzzy Comprehensive Evaluation,FCE),是一种运用模糊数学原理从多个指标对被评价事物隶属状况进行综合性评判,把被评判事物的变化区间做出区分的一种综合评价方法。因模糊数学可将模糊特性指标加以综合概况,现已被广泛应用到食品品质评价、风险评估等方面。如刘美迎等利用模糊数学综合评价了各鲜食葡萄品种的优劣[7];鉏晓艳等用模糊数学系统评价电子束辐照剂量对鲈鱼品质的影响[8];杜树新等运用模糊数学实现对食品安全状态的综合评价[9],但应用模糊综合评判法对宰后羊肉僵直成熟进程进行综合评判还未见相关研究报道。该方法不仅考虑冰温贮藏过程羊肉不同成熟进程各参数指标的信息量大小、相对重要性,还考虑肉样的个体差异性、模糊性和不确定性,获得被评价羊肉宰后不同僵直成熟进程的综合变化,使得判断结果更加科学、准确和可靠。本文通过对宰后冰温贮藏期间羊肉的电阻抗特性参数分析,将生物电阻抗特性结合模糊综合评判法应用于宰后冰温贮藏羊肉僵直成熟进程的判断,旨在通过电阻抗参数检测,及时掌握羊肉成熟进程,为冰鲜羊肉的工业化生产在线监测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绵羊 购于呼和浩特和林格尔牧场,品种为内蒙古细毛羊,16 只,6～8月龄,采用清真屠宰方式;氯化钾 天津市永大化学试剂三厂;氯化镁 北京化学试剂公司;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾 天津市科盟化工工贸有限公司;EGTA 国药集团化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。

LG-BCD冰温冷藏箱 泰州乐金电子冷机有限公司;pH-STAR型胴体直测式pH计 北京奥依克光电仪器有限公司;数控精密恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司;电子精密天平 德国Sartorius公司;DZ-400/2S型真空包装机 山东省诸城市利德机械有限责任公司;PY-1型膨胀压缩仪 南京电力自动化设备厂;2型四极式生物阻抗测量仪 华中科技大学生命科技学院;5810-R型低温台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肉样预处理 绵羊宰后,取左后腿股二头肌,平均分割为10 块,大小为5 cm×4 cm×2 cm,每块40 g左右,16只羊共计分成160份肉样,用聚乙烯包装袋(150 mm×200 mm×0.10 mm)进行真空包装。包装之后放入-1 ℃冰温箱中连续贮藏9 d,屠宰当日和之后每隔1 d对肉样的pH、失水率、肌原纤维小片化指数和电阻抗参数指标分别进行测定。

1.2.2 pH测定 按照GB/T 9695.5-2008《肉与肉制品pH测定》的方法进行测定[11]。将pH计插入羊肉中,记录其pH,每个样品重复测定3次,取其算术平均值为测定值。

1.2.3 失水率测定 按照加压重量法[12]。用膨胀压缩仪给面积为5 cm2,厚度为1 cm的肉样施加68 kPa的压力,测定被压出的水量与肉重之比即可计算出其失水率,失水率越大,保水性越差,按下面公式算其失水率。

式中:Q为肌肉失水率(%),W1为施压前肉重(g),W2为施压后肉重(g)。

1.2.4 肌原纤维小片化指数(MFI)测定 取2 g 肉样加20 mL 预冷的 MFI 缓冲液(100 mmol/L KCl,11.2 mmol/L K2HPO4,8.8 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L EGTA,1 mmol/L MgCl2)进行匀浆并离心(1000×g,15 min,2 ℃),取沉淀再用 20 mL 上述缓冲液混匀后离心(1000×g,15 min,2 ℃),取沉淀,加入 5 mL 上述缓冲液再次混匀,并过滤除去结缔组织,再加入 5 mL缓冲液洗离心管,并进行过滤。将过滤后的混合液测定蛋白浓度,然后用 MFI 缓冲液将其浓度稀释到0.5 mg/mL,在540 nm下测定其吸光度,将结果乘以 200,即为肌原纤维小片化指数[13]。

1.2.5 电阻抗特性测定 电阻抗值测量采用四针式电级法[10],电极间距1 cm,电极长为2 cm,测量时沿肌纤维组织横向插入电极约1 cm,如图1所示。通过生物电阻抗测量仪从5～200 kHz取12个频率点(5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 kHz),频率由低到高,测定每个样品的电阻抗幅值和相位角特性,利用迭代式最小二乘算法拟合出肉样等效电阻抗参数:细胞膜电容、细胞外阻、细胞内阻、介电损耗正切角、极化系数。

图1 阻抗测定方向示意图Fig.1 Denomination of electrical impedance tests

1.2.6 模糊数学模型建立

1.2.6.1 评价因素集确定 根据电阻抗参数显著性情况,建立羊肉宰后不同僵直成熟进程的评判体系,确立评判指标因素集U={u1,u2,u3,u4,…un}。

1.2.6.2 确定评判集 根据电阻抗参数在宰后僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期四个僵直成熟进程的变化范围,建立评价集V={v1,v2,v3,v4},v1为僵直快速期,v2为僵直最大期,v3为解僵期,v4为成熟期。

1.2.6.3 确立隶属函数 隶属函数的确定方法有许多种,隶属函数的确定方法有许多种,本文选用较为普遍使用的降半梯形分布函数,以确定隶属度。用i表示各个元素i=1,2,3,4,…n,用j表示僵直成熟进程j=1,2,3,4。隶属度用rij表示,取值范围为 0～1,进而得到模糊矩阵R,如下:

式(1)

1.2.6.4 确定模糊评判权重集 模糊综合评判法中赋权的方法有很多种,权重分配方案的合理与否直接影响着最后评判结果的正确率[14],本文采用的是超标倍数赋权和标准赋权法。超标倍数赋权法计算公式为:

式(2)

式中： Wi为第 i 项指标的权重值;Si为第 i 项指标在僵直成熟阶段的平均值,Xi为第 i 项指标在某个僵直成熟阶段的实测值。

形成模糊向量A=(W1,W2,W3,W4,…Wn)

变异系数赋权法是反映各指标变异程度的一种赋权方法[15],通过计算各指标的变异系数来衡量各指标的差异程度,以此来确定指标的权重,其计算公式为:

式(3)

式中：Vi为第 i 项指标的变异系数。

形成模糊向量A′=(W1,W2,W3,W4, …Wn)

1.2.6.5 模糊综合评判 利用模糊矩阵R和模糊向量A,根据模糊数学公式B=A·R,进行模糊矩阵的复合运算,得出宰后成熟进程模糊综合评判结果,B向量中的最大值表示综合评判的最佳结果。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel 2003进行数据处理,运用SPSS 19.0软件(IBM公司)对数据进行基于Duncan’s多重比较的方差显著性分析(P<0.05),对模糊权重系数和模糊判别过程进行分析[15-16]。

2 结果与分析

2.1 羊肉贮藏期间理化品质的变化

图2 宰后不同时间羊肉理化指标的变化Fig.2 Changes in physicochemical property values of mutton during ageing

如图2所示,在僵直快熟期,羊肉的pH呈快速下降趋势,失水率呈不断上升趋势,MFI指数呈先上升后下降趋势,但变化幅度不大。在僵直最大期,羊肉的pH、失水率、MFI指数变化不大。在解僵期,羊肉的pH呈缓慢上升的变化趋势,失水率呈不断升高的变化趋势,MFI指数不断升高。在成熟期,羊肉的pH、失水率变化不大,MFI指数持续升高。因此,根据宰后羊肉的pH、失水率、MFI指数三项理化指标的综合应用,可以确定羊肉宰后所处四个僵直成熟进程阶段的精准时间范围。在本研究中,羊肉在冰温贮藏条件下在宰后的8～48 h为僵直快速期;在宰后的48 h 时达到僵直最大化,并持续到宰后的72 h;从宰后72 h到168 h为解僵成熟过程;宰后168 h 以后羊肉进入后期成熟过程。

2.2 羊肉贮藏期间电阻抗特性的变化

肌肉组织的电阻抗特性主要取决细胞内外电阻率、细胞内外液体量、细胞膜容抗及广泛分布的电容等,多种因素的影响使电阻抗特性具有其复杂性,使得肌肉组织内部形成了复杂的电学网络。细胞膜电容Cm是衡量肌肉细胞膜完整性的指标,同一肌肉组织其Cm值越小,说明肌肉的细胞膜破损程度越大[17]。羊肉贮藏过程中细胞膜电容Cm的变化如图3a所示,在冰温贮藏过程中,随贮藏时间的延长肌肉组织的Cm逐渐降低,宰后8和216 h的Cm值分别为41.2、15.32 pF,且细胞膜电容Cm在不同贮藏时间存在显著性差异(P<0.05),说明肌肉细胞膜作为介电绝缘体,它的绝缘性能随着细胞膜磷脂双层的氧化和宰后细胞自身的溶解作用的增强,细胞膜的渗透性增强,而逐渐减小[18]。

图3 宰后不同时间羊肉电阻抗特性的变化Fig.3 Changes in the electrical impedance values of mutton during ageing

细胞外阻Re是反映肌肉组织细胞外液导电能力大小的指标,细胞外的离子强度越大,细胞外阻Re值越小,细胞总体的阻抗性越弱,导电性越强[19]。冰鲜羊肉贮藏过程中肌细胞外阻Re值变化规律如图3b所示。肉样Re值在宰后贮藏的过程中,呈现先上升后降低再趋于稳定的趋势,贮藏24 h时Re值达到最大。Jean-Louis等在研究宰后牛肉贮藏过程的介电特性时也得到类似结论[17],其原因可能是宰后随着肌肉僵直、解僵、成熟过程的进行,肌细胞膜不断降解破裂,细胞内外离子交换程度加强大,细胞内外逐步形成渗透压差,导致细胞外离子强度增加,导电性逐渐增强,细胞外阻Re逐渐减小[20]。

细胞内阻Ri是衡量肌肉细胞内液体导电能力大小的指标。对于肌肉组织,细胞内的离子强度越大,细胞内阻Ri越小,细胞阻抗越小,导电能力越强。冰鲜羊肉贮藏过程中细胞内阻Ri值变化如图3c所示,随着贮藏时间的延长,肉样的细胞内阻Ri值呈现先增加后减少的趋势,在贮藏24 h时肉样的Ri值达到最大值,这可能是由于贮藏时间的延长,肌肉组织内质网和线粒体中的Na+、Cl-和K+等离子从细胞器中被逐步释放出来,细胞内离子数量强度增加,导电能力上升,细胞内阻抗降低[19]。随着宰后羊肉成熟过程的进行,肌肉的细胞内阻Ri值趋于稳定。

肌肉组织的介电能力由两部分组成,即主动部分和被动部分。主动部分ε′是表示肌肉组织的相对透电能力,被动部分ε″表示肌肉组织可吸收的能量,ε″和ε′的比值称为介电损耗正切角(tanδ),其值大说明肌肉组织吸收电能的能力强于扩散的电能,其值小说明肌肉组织吸收电能的能力弱于扩散的电能[21]。冰温贮藏过程中肉样的tanδ值变化如图3d所示,刚宰后肉样的tanδ值最大,之后随着贮藏时间的延长,肉样的tanδ值呈单调下降的趋势,这说明羊宰后随着僵直化的进行,肌肉组织细胞膜不断降解,肌肉组织的吸收电能力降低,透过电能力增强,从而使肌肉组织的介电损耗正切值呈单调下降的趋势。

极化系数k是衡量肌肉生命状态的一个指标,肌肉细胞在死亡过程中其极化能力会发生崩溃,相应地肌肉组织电阻抗离散度和极化系数都会减小。从肌肉细胞开始死亡到结束,极化系数从最大值逐渐降低到单位数值1[22]。 冰温贮藏过程中肌肉的极化系数k变化规律如图3e所示,刚宰后肌肉的极化系数k值最大,随着贮藏时间的延长,肉样的极化系数k值也呈逐渐下降的趋势,这可能是由于羊宰后随着肌肉僵直、成熟的进行,肌肉组织的生命状态不断衰竭,使肌肉组织在高频和低频状态下的生物电阻抗值的差距越来越小。

2.3 有效电阻抗参数提取

为了明确宰后僵直成熟进程对羊肉电阻抗参数的影响,本实验使用方差分析对其进行了统计学分析,羊肉在冰温贮藏过程四个僵直阶段电阻抗参数变化范围如表1所示。宰后僵直和成熟过程5种电阻抗参数差异显著(P<0.01),可确立评判指标因素集U={u1,u2,u3,u4,u5}其中u1为细胞膜电容,u2为细胞内阻,u3为细胞外阻,u4为介电损耗正切角,u5为极化系数。

表1 羊肉僵直成熟各阶段电阻抗参数变化范围值Table 1 Variation range of electrical impedance parameter of mutton during rigor process

这样就可以确立细胞膜电容、细胞内阻、细胞外阻、介电损耗正切角、极化系数5个评判指标因子在僵直快速期、僵直最大期、解僵期、成熟期所对应的隶属函数。xi表示羊肉僵直成熟过程第i种电阻抗参数的实测值;用Tij表示第i种电阻抗参数在第j个僵直成熟过程的最大值;用rij表示第i种电阻抗参数对第j个僵直成熟过程的隶属度,则隶属度的计算公式如下:当j=1时,僵直快速期隶属函数式为:

式(4)

当j=2,3时,僵直最大期、解僵期隶属函数式为:

式(5)

当j=4时,成熟期隶属函数式为:

式(6)

2.4 模糊综合评判

利用模糊矩阵R和模糊向量A,根据模糊数学公式B=A·R,进行模糊矩阵的复合运算,得出宰后成熟进程模糊综合评判结果,B向量中的最大值表示综合评判的最佳结果。以宰后8 h的某肉样为例:[Cm]=43.1pF,[Ri]=10.6 Ω,[Re]=182 Ω,[tanδ]=1.35,[k]=5.8按式(4)至(6)算得各指标各级隶属度,得出模糊关系矩阵R。

根据超标倍数赋权法公式(2),得出权重向量A=(0.30,0.11,0.16,0.19,0.24)

按照变异系数赋权法公式(3),得出权重向量A′=(0.18,0.17,0.26,0.17,0.22)

再将A、A′分别与隶属矩阵R进行模糊矩阵运算,得出羊肉僵直进程各阶段模糊评判计算结果B和B′。

B=(0.30,0.11,0.16,0.19,0.24)

B向量中的最大值为0.647,所得模糊评判结果为羊肉宰后僵直成熟进程的僵直快速期,这与实际相符合。同理算得B′=(0.490,0.254,0.149,0.106),B′向量中的最大值为0.490,所得模糊评判结果同为宰后僵直快速期,符合实际情况,但B向量中最大值要明显大于B′向量中的最大值(0.647>0.490)。表明超标倍数赋权法准确度高于变异系数赋权法。

2.5 模糊模型验证

为了检验两种不同模糊评判模式的实际检验正确性,取宰后0～9 d成熟过程中28个左后腿肉样对其进行了验证试验。验证样品胴体重为15～20 kg,采用伊斯兰清真屠宰方式。验证结果表明,两种评判模式都实现了对宰后羊肉僵直成熟进程的准确评判,但超标倍数赋权法所得的模糊综合评判结果正确率(93%)要高于变异系数赋权法所得结果正确率(86%),验证结果如表2所示,说明采用超标倍数赋权法所得的模糊综合评判精准度要优于变异系数赋权法。

表2 两种不同评判模式的肉样验证结果Table 2 Evaluation results of samples with different models

3 讨论

动物肌肉组织受个体差异、宰后肌肉僵直、解僵和成熟过程引起的生理生化反应等影响,肉品质与电参数指标之间的相关性通常很不固定,线性相关性也不是很大[23]。所以利用常规的线性回归模型,很难实现使用电参数建立对肉品质的评估预测模型,必须结合一些特定的数学方法才能达到有效的评价效果。本实验研究表明,使用模糊综合评判法对宰后羊肉僵直成熟进程进行评价是一种比较理想的方法,并且能够建立可靠、稳定的冰温贮藏羊肉僵直成熟进程预测模型。

但需要指出的是,本试验所用的样品为绵羊后腿股二头肌,测定的电阻抗值为横向电阻抗。不同部位、不同月龄、不同电阻抗测定方向等因素都会对肌肉的电阻抗值产生影响[17-20]。此外模糊综合评判法中赋权方法很多,权重分配方案的合理与否直接影响到评价结果的准确性度,本文选用较为普遍使用的降半梯形分布函数以确定隶属度,使用超标倍数赋权法和变异系数赋权法两种方法确定模糊评判权重集。经验证结果表明,两种评判模式都实现了对宰后羊肉僵直进程的准确评判,但采用超标倍数赋权法所得的模糊综合评判结果精准度要优于变异系数赋权法所得评判结果。因此,未来研究工作应该加大样本的采集量,筛选出准确率更高的隶属函数和模糊赋权法,实现对不同部位冰温贮藏羊肉僵直成熟进程的在线精准判别。

4 结论

羊肉在冰温贮藏条件下在宰后的48 h时达到僵直最大化,从宰后72 h到168 h为解僵成熟过程;宰后168 h以后进入后期成熟过程。羊肉在宰后不同僵直成熟过程5种电阻抗参数差异极显著(P<0.01),提取Cm、Ri、Re、tanδ、k 5个参数指标,利用模糊矩阵R和模糊向量A,建立模糊评价模型公式B=A·R。通过两种不同权重模糊评价法对宰后冰温贮藏羊肉的僵直成熟进程进行综合评价,构建了两种模糊综合评价模型,经验证准确率在0.86以上,超标倍数赋权模型准确度(0.93)高于变异系数赋权模型。电阻抗测量结合模糊评价做为一种快速无损的羊肉僵直成熟进程监测方法,具有很大的工业生产应用潜力。