覃卫娟 黄卫彤 叶致龄

【摘要】 目的：對南宁市1 001例听力正常的孕期女性进行耳聋基因检测，了解本市常见耳聋基因突变类型和携带情况，为遗传咨询和优生优育提供数据。方法：在知情同意情况下，抽取孕妇外周血提取DNA，用微阵列芯片法检测GJB2基因c.35delG、c.235delC、c.176dell6和c.299-300delAT位点，GJB3基因c.538C>T位点、SLC26A4基因c.2168A>G和c.IVS7-2A>G位点、线粒体12S rRNA m.1555A>G和m.1494C>T位点。并对GJB2进行全基因组测序，以便发现更多与耳聋相关的突变位点。结果：1 001例孕期女性中微阵列芯片法共检测出18例（1.80%）致病性耳聋基因突变位点，其中GJB2突变c.235delC位点6例（0.60%），c.299-300delAT位点2例（0.20%），c.176dell6和c.35delG位点未检出突变;GJB3基因突变c.538C>T位点3例（0.30%）;SLC26A4基因突变c.2168A>G位点1例（0.10%），c.IVS7-2A>G位点5例（0.50%）;线粒体12S rRNA检出m.1555A>G突变1例（0.10%）。GJB2全基因测序发现318例（31.77%）孕妇携带致病性基因突变，常见的致病突变位点：c.109G>A 295例（29.47%）、c.11G>A突变15例（1.50%）、c.-23+1G>A突变7例（0.70%）。结论：南宁市孕妇GJB2基因突变携带最高，其次GJB3、SLC26A4、线粒体12S rRNA，致病性突变位点有GJB2基因：c.109G>A、c.11G>A、c.-23+1G>A、c.235delC和c.299-300delAT;GJB3基因：c.538C>T;SLC26A4：c.2168A>G和c.IVS7-2A>G;线粒体12S rRNA m.1555A>G。因此，孕期女性进行耳聋基因筛查，在预防遗传性耳聋患儿出生中有重要价值。

【关键词】 耳聋基因 孕妇 产前筛查

Analysis of the Screening Results of Deafness Genes in Pregnant Women in Nanning/QIN Weijuan， HUANG Weitong， YE Zhiling. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： 0-080

[Abstract] Objective： The detection of deafness genes in 1001 pregnant women with normal hearing in Nanning City was conducted to understand the mutation types and carrying status of common deafness genes in this city， and provide data for genetic counseling and prenatal and postnatal care. Method： DNA was extracted from the peripheral blood of pregnant women with informed consent. Microarray chip was used to detect the c.35delG， c.235delC， c.176dell6 and c.299-300delAT loci of GJB2 gene， c.538C>T loci of GJB3 gene， c.2168A>G and c.IVS7-2A>G loci of SLC26A4 gene， m.1555A>G and m.1494C>T loci of mitochondrial 12S rRNA. The whole genome of GJB2 was sequenced in order to find more mutation sites associated with deafness. Result： A total of 18 cases （1.80%） of pathogenic deafness mutations were detected by Microarray chip in 1001 pregnant women， Among them， GJB2 gene mutations were found in 6（0.60%） cases at c.235delC site， 2 cases （0.20%） at c.299-300delAT site， and no mutations were found at c.176del6 and c.35delG site; gjb3 gene mutations were found in 3 cases （0.30%） at c.538c > T site; SLC26A4 gene mutations were found in 1 case （0.10%） at c.2168A > G site and 5 cases （0.50%） at c.IVS7-2A> G site; mitochondrial 12SRNA mutations were found in 1 case （0.10%） at m.1555a > G site. GJB2 whole-genome sequencing found that 318 pregnant women （31.77%） carry pathogenic gene mutations. The common pathogenic mutation sites are c.109G>A with 295 cases （29.47%）， c.11G>A with 15 cases （1.50%） and c.-23+1G>A with 7 cases （0.70%）. Conclusion： GJB2 gene mutation is the highest in Nanning pregnant women， followed by GJB3， SLC26A4 and mitochondrial 12S rRNA. Pathogenic mutation sites are GJB2 gene： c.109G>A，c.11G>A， c.-23+1G>A， c.235delC and c.299-300delAT; GJB3 gene： c.538C>T; SLC26A4 ：c.2168A>G and c.IVS7-2A>G; mitochondrial 12S rRNA m.1555A>G. Therefore， the screening of deafness gene in pregnant women is of great value in preventing the birth of hereditary deafness.

[Key words] Deafness gene Pregnant women Prenatal screening

First-authors address： Nanning Maternal and Child Health Hospital， Nanning 530011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.019

目前国内外研究已证实50%以上的耳聋人群是遗传因素导致[1]，与耳聋相关的遗传基因有GJB2、JGB6、GJB3、MYO7A、MYO15A、OTOF、SLC26A4等。我国常见的非综合征型耳聋基因位点是GJB2的c.235delC，c.299-300delAT，c.176del16，c.35delG位点;SLC26A4的c.919-2A>G和c.2168A>G位点;线粒体12S rRNA的m.1555A>G和m.1494C>T位点;GJB3的c.538C>T位点[2]，近5年来国内有报道采用基因芯片法對新生儿进行GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12S rRNA筛查，发现遗传性耳聋基因携带率约为4.7%[3]，尤其是GJB2致病性突变最高，有显著的种族区域差异。如果孕期女性进行耳聋基因筛查，可以发现遗传基因突变位点，可做预防和早期干预，能有效地降低耳聋患儿的发病率。本研究采用微阵列芯片对南宁市1 001例听力正常的孕期女性进行GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12S rRNA基因9个位点检测，并对GJB2进行全基因测序，旨在了解南宁市孕期女性耳聋基因突变携带情况，扩大GJB2基因突变位点检测，以便发现更多的致病位点，为临床提供更可靠的预防和诊断依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年6-12月来自南宁市妇幼保健院产前门诊的孕期女性。纳入标准：孕周7～20周，听力正常的孕期女性。排除标准：直系亲属有听力障碍者。本研究遵循医学伦理学相关规定，取得了所有研究对象的知情同意，并得到南宁市妇幼保健院的伦理委员会许可批准。

1.2 芯片法 采集孕期女性外周血2 mL，提取DNA，检测浓度及纯度。使用微阵列芯片法晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（成都博奥生物有限公司）对1 001例孕妇进行遗传性耳聋基因检测，检测基因位点：GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176dell6和c.299-300delAT），GJB3（c.538C>T），SLC26A4（c.2168A>G、c.IVS7-2A>G），线粒体12S rRNA（m.1555A>G、m.1494C>T）。按照试剂盒说明书进行PCR扩增、杂交、洗片、芯片扫描及判读。

1.3 测序法 使用全基因测序法检测1 001例孕妇GJB2基因。（1）文库构建，PCR扩增根据样品量计算需配制的PCR扩增体系，选取目的片段扩增程序进行扩增;（2）文库纯化;（3）文库质检：参照KAPA Library Quantification Kit Illumina? platforms TDS对文库进行定量;（4）测序：将文库pooling，变性最终以1.8 pM的文库上机测序。生物信息学分析：利用GATK工具判读SNP和Indel位点;利用Snpeff工具注释SNP，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库、clinvar数据库进行注释和比较分析。

2 结果

2.1 芯片法和测序法基因突变情况 （1）1 001例孕期女性中使用基因芯片共检测出18例（1.80%）耳聋基因突变，均为杂合子。其中GJB2突变c.235delC位点6例（0.60%）、c.299-300delAT位点2例（0.20%），c.176dell6和c.35delG位点未检出突变;GJB3基因c.538C>T位点突变3例（0.30%）;SLC26A4基因突变c.2168A>G位点1例（0.10%）、c.IVS7-2A>G位点5例（0.50%）;线粒体12S rRNA检出m.1555A>G突变1例（0.10%），m.1494C>T位点未检出突变。（2）对GJB2进行测序共发现607例（60.64%）孕期女性携带有突变，其中致病性突变318例（31.77%），318例携带GJB2致病性突变的孕妇中，c.109G>A位点突变295例，占致病性突变的92.77%。GJB2测序结果有32种基因型，其中致病性基因型18种，多态性和未分类基因型有14种。18种致病性基因型中纯合子有21例（2.10%）均为c.109G>A突变;杂合子290例（28.97%），分别是：c.109G>A/wt 188例，c.109G>A/wt、c.217C>A/wt 8例，c.109G>A/wt、c.608T>C/wt 30例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt 5例，c.109G>A/wt、c.-121G>A/wt 1例，c.109G>A/wt、c.444C>T/wt 1例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt、c.341A>G/wt 36例，c.109G>A/wt、c.79G>A/wt、c.217C>A/wt 5例，c.11G>A/wt 8例，c.235delC/wt 4例，c.235delC/wt、c.79G>A/wt、c.341A>G/c.341A>G 2例，c.299-300delAT/wt 2例;c.109G>A/wt单杂合子是最常见的基因型共188例（18.78%）;复合杂合子7例（0.70%），测序结果发现的复合杂合子7例（0.70%）是c.11G>A和c.-23+1G>A复合杂合突变，分别是c.11G>A/wt、c.-23+1G>A/wt、c.217C>A/wt基因型5例，c.11G>A/wt、c.-23+1G>A/wt、c.608T>C/wt基因型2例;测序同时还发现c.11G>A突变杂合子8例（0.79%），c.235delC突变杂合子6例（0.60%），c.299-300delAT突变杂合子2例，c.176dell6和c.35delG突变未检出，与芯片法检测结果一致。GJB2测序结果中最常见的多态性基因型是c.79G>A/wt、c.341A>G/wt共99例（9.89%）。见表1。