鄢 嫣 焦 叶 曾茂茂 陈 洁 江 舰*

（1 安徽省农业科学院农产品加工研究所 合肥 230031 2 长沙理工大学化学与食品工程学院 长沙 410114 3 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室 江苏无锡 214122）

杂环胺（HAAs）是一类具有致癌和致突变性质的杂环芳香烃类化合物，普遍生成于高温加工肉制品中[1]。2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（PhIP）是肉制品中最为常见且含量最多的HAAs，高温长时间加热肉制品会大量产生PhIP[2]。早期研究发现，PhIP 能诱导动物机体内多器官患癌[3-4]。加工肉制品是我国人民日常饮食中重要的组成部分，人类长期摄入含有PhIP 的食物会极大程度增加其患癌风险[5-6]。深入探索肉制品中PhIP的抑制方法和机制，具有很高的研究价值。

香辛料是肉类加工中常用的调味品，可赋予肉制品独特的风味，同时也被证明可显著影响HAAs 的形成[7-8]，是最具应用价值的一类杂环胺抑制剂。黑胡椒具有去腥、提味、增香、增鲜、除异味、防腐和抗氧化[9]等作用，在肉制品中使用非常广泛，如烤肉串、煲汤、热炒、腌腊酱卤、香肠火腿、炸鸡等。研究发现，向肉制品中添加胡椒对HAAs 的形成有显著的抑制作用[10-11]。例如，Oz 等[12]发现黑胡椒对3 种温度（175，200 ℃和225 ℃）下油炸高脂肉丸中PhIP 的抑制率可达100%。同时近期研究也发现，黑胡椒在一定加工条件下对HAAs 形成有促进作用[13]。在不同加工体系下，添加黑胡椒对HAAs 形成的影响有显著差异。这可能与黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的组分在不同加工条件下的性质变化有关。据现有报道，黑胡椒中含有多种活性成分，如生物碱、有机酸、烯帖类、酚类等[14-15]。这些化合物性质差异很大，在不同加工条件下，其溶解度、热敏性等性质也有显著差异。为安全、有效地利用黑胡椒这一天然PhIP 抑制剂，明确黑胡椒对PhIP 抑制活性影响最显著的组分，显得尤为重要。

对植物源活性成分的鉴定，传统方法包括试剂萃取、柱分离、制备液相色谱分离、质谱分析及核磁共振鉴定等。然而，采用传统手段从植物复杂成分中找出一对或多种具有特定活性的组分，往往需要对各组分进行逐一分离。代谢组学是研究生物体在外源或内源性刺激下体系小分子变化的一种整体性分析策略[16]。目前，借助代谢组学的研究思路对复杂体系中的关键化合物的鉴定已有应用[17-18]。研究人员通常采用各种现代仪器方法，建立目标体系的特征谱后，运用化学计量学方法建立不同条件下的谱效关系，并筛选影响这一关系的关键小分子物质。本研究以高温油炸猪肉为PhIP 抑制效果的供试体系，以具有PhIP 抑制活性的香辛料黑胡椒为研究对象，通过构建黑胡椒提取物的HPLC 谱与其PhIP 抑制效果，建立谱效关系，对黑胡椒中抑制PhIP 活性具有显著影响的组分进行筛选和鉴定。为开发和合理利用黑胡椒这一PhIP 抑制剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜猪肉，合肥市永辉超市四里河店；除去肥肉，绞碎后，备用。黑胡椒，合肥当地菜市场；清洗，粉碎，过100 目筛后，备用。

杂环胺2-氨基-1-甲基-6 苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（PhIP），美国Santa Cruz Biotechnology 公司；内标1，3，7-三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮（Caffieine）、标准品：丁子香酚、槲皮素，上海百灵威试剂公司；Oasis MCX 固相萃取用小柱（60 mg，3 mL），美国Waters 公司；乙腈（色谱纯），美国Thermo-Fisher Scientific 公 司；乙 酸 铵、盐 酸（HCl）、甲醇、氨水（25%）均为分析纯级，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity 超高效液相色谱系统（UPLC）、串联Waters Acquity 三重四极杆质谱检测器或飞行时间质谱检测器（ESI 源）、配备Waters Acquity UPLC BEH C18柱（50×2.1 mm i.d.，1.7 μm）、Alliance 高效液相色谱系统、串联Waters 2487 紫外检测器、配备Xbridge C18柱（150×2.1 mm i.d.，3.5 μm），美国Waters 公司；Rational AG电子烤箱，德国National 公司；SPE-01 Ⅱ八通道全自动固相萃取仪，加拿大博朗科技有限公司；3K15 冷冻离心机，美国Sigma 公司；T25 高速分散机，德国IKA 公司；纯水净化系统，美国Millipore公司；QGC-12T 氮吹仪，上海泉岛公司；PTC 系列超声波清洗机，湖北鼎泰生化科技设备制造有限公司；EYELA N-1100D-W（WD）旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；FD-ICE 冷冻干燥剂，北京德天佑科技发展有限公司；HH-6 高精度数显恒温水浴锅，上海邦西仪器科技有限公司；料理机，九阳股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑胡椒提取物的制备

1）黑胡椒乙醇提取物和水提取物的制备 取粉碎好并过筛的黑胡椒粉末，以料液比1∶20 加入不同体积分数的乙醇（80%，100%）或超纯水后，采用不同提取方式（超声、水浴）在不同的提取温度（50，60，70 ℃）下提取一定时间（30，60，90 min），冷却至室温后，离心20 min（离心力5 000 g），取上清液浓缩至少量后，冻干，备用。

2）黑胡椒挥发油的制备 参考文献[19]制备黑胡椒挥发油。取粉碎好并过筛的黑胡椒粉末，以料液比1∶10 加入超纯水后，浸泡12 h。采用水蒸气蒸馏5 h 后。冷却至室温，冻干，备用。

1.3.2 黑胡椒乙醇提取物HPLC 图谱的建立 采用高效液相色谱对上述所得的黑胡椒乙醇提取物进行测定。测定条件：色谱柱，Xbridge C18柱（150×2.1 mm i.d.，3.5 μm）；流动相，（A）0.1%甲酸，（B）乙腈；梯度洗脱程序：0.01～10 min，35%～40%B；10～12 min，40%～48%B；12～60 min，48%～84%B；60～62 min，84%～100%B；62～80 min，100%B；流速0.3 mL/min。

1.3.3 添加黑胡椒提取物的焙烤猪肉模拟体系的构建 向上述黑胡椒提取物冻干粉末中加入超纯水，制备成提取物溶液或悬浊液，加入40 g 绞碎的猪肉，用料理机充分搅拌均匀，提取物的添加量为1%。用直径6 cm 的表面皿将肉糜压制成肉饼后，置于烤箱225 ℃焙烤20 min（每10 min 翻面1次）。冷却后，将烤肉饼粉碎成粉末，待测。

1.3.4 猪肉体系中PhIP UPLC-MS/MS 测定方法的建立 采用乙腈提取法[20]结合UPLC-MS/MS 对上述烤肉模拟体系中的PhIP 进行测定。具体方法：取4 g 上述烤肉粉末，加入25 mL 乙腈均质后超声提取15 min。冷冻离心（11 363×g，10 min，4℃）后，收集上清液。上述提取步骤重复2 次后，合并上清液，定容至50 mL，进行固相萃取（Solid phase extraction，SPE），对杂环胺进行净化和富集。

在使用前，先对Oasis MCX 固相萃取小柱进行活化。活化试剂先后分别为6 mL 甲醇、6 mL 超纯水、3 mL 乙腈活化。用滤纸将上述样品提取液过滤后，上样，再先后用6 mL 0.1 mol/L HCl 和6 mL 甲醇淋洗，除去未吸附的极性和非极性杂质。最后，采用6 mL 甲醇∶氨水（95∶5，体积比）洗脱吸附在柱上的PhIP。用氮气在45 ℃下将上述洗脱液吹干后，加入400 μL 甲醇复溶，并采用0.22 μm尼龙针孔滤器过滤。加入内标Caffeine 后，进行UPLC-MS/MS 检测。

UPLC-MS/MS 测定方法：采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100×2.1mm i.d.，1.7 μm）进行分离，流动相为（A）10 mmol/L 乙酸铵水溶液（pH 6.8），（B）乙腈，梯度洗脱程序：0～0.1 min，10%B；0.1～18 min，10%～30% B；18～20 min，30%～100%B；20～20.1 min，回到初始浓度；流速设定为0.3 mL/min。三重四极杆质谱条件为：质谱电离源，电喷雾电离源（ESI 源），ESI+，多反应监测模式（MRM模式）；源温：120 ℃；毛细管电压：3.5 V；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气（纯度99.0%氮气）流速：650 L/h；碰撞气（纯度99.9%氩气）流速：0.13 mL/min；锥孔气（纯度99.0%氮气）流速：60 L/h。PhIP 的MRM 模式下的参数（母离子、定性离子、定量离子、锥孔电压、碰撞能量）由仪器自带的Intellstart功能自动优化得到，优化结果见表1。

1.3.5 方法学考察 分别从线性范围、最低检测限（LODs）、最低定量限（LOQs）、方法回收率、精密度等方面对PhIP 的测定方法进行了考察。具体方法如下：

1）线性范围 向猪肉空白样品中加入9 种个浓度梯度的PhIP 标准品，并加以测定。分别以加入标准品的浓度为横坐标，以HAAs 与内标的峰面积比值为纵坐标，绘制线性曲线，并进行线性回归分析。

2）LODs 和LOQs 稀释PhIP 标准品分别记录当HAAs 信噪比达到3 和10 时的质量浓度，即为各目标物的LODs 和LOQs，单位为μg/L。

3）回收率 向猪肉样品中加入一定量的PhIP 标准品后，采用1.3.4 节所述预处理方法提取和净化后，测定PhIP 含量。以如下公式计算回收率：

[（加标样品中目标物含量-空白不加标样品中目标物含量）/加入标准品量]×100%。

4）精密度 在测定加标回收率时，在同一天内测定向空白猪肉加入低浓度标品后的加标回收率数据，计算所得的RSD 值，即为日内精密度。根据连续3 d 测定所得的高浓度加标回收率数据，计算RSD 值，即为日间精密度。

1.3.6 数据处理 采用Masslynx 4.1 SCN 805 软件对UHPLC-MS/MS 所得的数据进行采集和积分。采用Statistics 9.0 软件程序中的一般线性模型对数据进行方差分析和显著性分析（P＜0.05）。采用SIMCA 13 软件对黑胡椒提取物HPLC 各峰面积及提取物的PhIP 抑制率进行主成分分析（PCA），用以明确黑胡椒乙醇提取物中对其PhIP抑制效果有显著影响的化合物。

2 结果与分析

2.1 焙烤猪肉体系中PhIP 的测定结果

采用乙腈提取法结合UPLC-MS/MS 对各焙烤猪肉模拟体系中PhIP 含量进行测定，并对测定的方法学参数进行考察。采用该PhIP 测定方法，所得的烤肉样品中PhIP 的MRM 谱图，如图1 所示，方法学数据如表1 所示。结果表明，本研究所采用的测定方法使得PhIP 在一个相对宽的范围（2.30～147.50 ng/mL）内具有良好的线性，相关系数为0.9965。样品加标后测得方法的LODs 和LOQs 分别为0.104，0.311 ng/g，满足对于痕量PhIP 检测要求。方法回收率达76.4%以上，相较于现行传统方法所得测定结果准确、可靠[21-22]。方法日间精密度达9.36%以下，说明该方法结果稳定，重现性良好。

图1 烤肉样品中PhIP 的MRM 谱图Fig.1 MRM chromatograms of PhIP in roasted pork samples

表1 PhIP 三重四极杆质谱MRM 及测定方法学参数Table 1 MRM parameters of triple quadruple detector and the methodological parameters

2.2 不同试剂提取的黑胡椒提取物对PhIP 形成的影响

采用超纯水在不同提取温度（50，60，70 ℃）和提取时间（30，60，90 min）下对黑胡椒进行提取，结果发现，添加所得的黑胡椒水提物对PhIP 的形成均无抑制作用，其中70 ℃下提取90 min 的水提物对PhIP 的促进率最低。

同时，比较了70 ℃下提取90 min 的水提物与相同条件下的乙醇提取物以及挥发油的添加对焙烤猪肉体系中PhIP 形成的影响。结果发现（图2），添加水提物对PhIP 有一定的促进作用。反之，黑胡椒的乙醇提取物以及挥发油对PhIP 有较为显著的抑制作用，抑制率分别为51.5%和74.6%。由此可见，3 种提取物中，乙醇提取物的抑制效果最好。

根据上述结果可知，黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的是一种或多种可溶解于乙醇的化合物。而黑胡椒中的亲水类化合物不具备抑制活性，甚至对PhIP 的形成有一定的促进作用。因此，黑胡椒更适合应用在含油的加工体系（如油炸肉制品）中。早期研究表明，含油加工体系中PhIP 的形成量会大大增加[23-24]，因此，黑胡椒在这一体系中的应用就显得尤为必要。同时，明确黑胡椒乙醇提取物中对PhIP 有显著抑制作用的成分，可为其在加工过程中的合理应用提供理论支持。

2.3 不同条件下提取的黑胡椒乙醇提取物对PhIP 形成的影响

图2 添加黑胡椒提取物后烤肉中PhIP 含量的比较Fig.2 Comparison of the PhIP levels in roasted pork added with black pepper extracts

采用不同提取方式（超声、水浴），不同乙醇体积分数（80%和100%），不同提取温度（50，60，70℃）以及不同提取时间（30，60，90 min）对黑胡椒进行提取，制备24 个黑胡椒乙醇提取物，并比较了上述乙醇提取物的PhIP 抑制率。结果可见，采用不同提取参数所得的提取物对烤肉饼体系中PhIP的抑制率差异较大（表3）。采用100%乙醇，超声提取60 min 后，所得的乙醇提取物对PhIP 的抑制效果最好，抑制率可达99.4%。

对上述24 个黑胡椒乙醇提取分别进行HPLC分析，所得HPLC 图谱如图3 所示。通过比对24个提取物的HPLC 图谱，共找出17 个共有峰。将共有峰进行积分处理，所得的峰面积数据用于后续PCA 建模分析。

2.4 黑胡椒乙醇提取物中对PhIP 的形成有显著影响的关键化合物

为明确黑胡椒乙醇提取物中影响其抑制PhIP形成活性的化合物，采用主成分分析法对上述乙醇提取物的共有峰面积和PhIP 抑制率进行分析。将上述所得的24 个黑胡椒提取物的PhIP 抑制率分为3 组，分别为a 组＜50%，b 组50%～80%和c组＞80%。采用主成分分析法，对黑胡椒提取物HPLC 谱图中17 个共有峰的峰面积进行降维，建立提取物PhIP 抑制率及其组分之间的关系，所得主成分散点图，如图4 所示。分析结果可见，主成分分析建模结果能良好的代表数据组真实性（累计R2X＞0.737，数据交互系数＞0.451）。24 个样本在PCA 图谱中分散分布，且来自于不同样本组的样本在PC1 方向上明显分离。可见具有不同PhIP 抑制率的提取物中的共有峰的峰面积存在显著差异。

表3 不同提取条件所得黑胡椒乙醇提取物PhIP 抑制率的比较Table 3 PhIP inhibitory efficiency comparison of the black pepper ethanol extracts obtained under different extracting conditions

图3 黑胡椒乙醇提取物HPLC 图谱Fig.3 HPLC chromatogram of black pepper ethanol extracts

通过分析PCA 样本载荷图（图5）可以看出，各共有峰对主成分的贡献度差异很大，其中峰5、峰10（图5 中红色圆圈圈内样本点）对样本的分离有最为突出的贡献。其所代表的化合物含量对黑胡椒提取物的PhIP 抑制活性影响最显著。峰5、峰10 是决定黑胡椒提取物PhIP 抑制活性的关键峰。

2.5 关键化合物的鉴定

采用HPLC-TOF-MS 法对峰5 和峰10 进行质谱分析。结果发现，黑胡椒乙醇提取物中峰5 和峰10 的质谱图谱与丁子香酚和槲皮素的标准品质谱图基本一致，且分子离子峰、碎片离子峰的组成和比例也大致相同，其化合物分子结构式和黑胡椒提取物中质谱谱图见图6。同时，将黑胡椒提取物的HPLC 图谱与丁子香酚和槲皮素标准品的HPLC 图谱进行比对，发现提取物中峰5、峰10 的保留时间分别为24.308，28.430 min，与标准品谱图（图7）一致，可进一步鉴定出关键峰：峰5 为丁子香酚，峰10 为槲皮素。

图4 黑胡椒乙醇提取物共有峰面积-抑制率主成分分析散点分布图Fig.4 PCA score scatter plot of common peak areas in black pepper ethanol extracts with different PhIP inhibitory efficiencies

图5 主成分分析载荷图Fig.5 PCA Loading plot of the common peak

图6 黑胡椒提取物中峰5（a）和峰10（b）的质谱谱图Fig.6 MS spectras of peak 5（a）and peak 10（b）in black pepper ethanol extracts

图7 关键峰丁子香酚（a）和槲皮素（b）标准品HPLC 谱图Fig.7 Key peak HPLC chromatrograms of eugenol（a）and quercetin（b）standards

本研究在建立一系列黑胡椒乙醇提取物HPLC 谱图的基础上，通过建立谱峰面积和提取物PhIP 抑制率的主成分分析模型，筛选并鉴定出提取物中对PhIP 抑制率影响最为显著的关键物质为槲皮素和丁子香酚。其中，槲皮素对于杂环胺的抑制作用早有报道，研究认为槲皮素可通过与PhIP 形成中间体加合产生新化合物，从而抑制PhIP 的形成[25]。黑胡椒中存在一定量的槲皮素[26]，而本研究的结果表明，槲皮素具有抑制PhIP 活性的作用，并且可进一步说明黑胡椒中的槲皮素含量对抑制PhIP 活性有显著影响。丁子香酚作为黑胡椒中重要的香气成分[27]是黑胡椒中多酚类化合物的一种。前期研究表明，多种植物中的多酚类化合物均对杂环胺有一定的抑制作用[28-29]，而丁子香酚对杂环胺的抑制作用，直至目前尚未明确。因此，本研究认为黑胡椒中丁子香酚是影响其抑制PhIP 活性的关键化合物，此结论可为进一步研究黑胡椒中丁子香酚对PhIP 的抑制途径和规律提供理论依据。

3 结论

本研究在准确测定烤肉中PhIP 含量的基础上，分别比较了黑胡椒水提物、乙醇提取物和挥发油对PhIP 抑制率的影响，结果发现3 种提取物中，乙醇提取物的抑制效果最好，抑制率可达74.6%。由此可推测，黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的是一种或多种可溶于乙醇的化合物。

改变提取方式、乙醇体积分数、提取温度和提取时间，分别制备了24 种黑胡椒乙醇提取物，通过测定其PhIP 抑制率，结果发现体积分数100%的乙醇超声萃取60 min 所得的提取物抑制率最高。采用主成分分析法对上述24 个黑胡椒乙醇提取物HPLC 谱峰面积及其PhIP 抑制率进行分析，结果发现24 个样本中来自不同抑制率组的样本在PCA 图谱PC1 方向上明显分离，其中峰5、峰10 样本对分离贡献最大，是决定黑胡椒提取物PhIP 抑制活性的关键峰。经UPLC-TOF-MS 分析结合标准品对比、鉴定出2 个关键峰分别为丁子香酚和槲皮素，说明这两种物质是黑胡椒乙醇提取物中影响其抑制PhIP 活性的关键化合物。