骆 航，李华生，王文渊

（永州职业技术学院医学院，湖南 永州 425100）

宽中顺气丸由香附（醋炙）、陈皮、莪术（醋炙）、三棱（麸炒）、木香、五灵脂（醋炙）、猪牙皂、黄芩、牵牛子、大黄、滑石11 味药材组成，临床上主要用于气血郁滞、停食停水引起的胸膈痞满、膨闷胀饱、不欲饮食、脘腹胀痛、大便秘结等病症的治疗［1］。方中香附（醋炙）疏肝解郁，理气宽中，为君药；辅以木香、陈皮行气燥湿，健脾消食；五灵脂（醋炙）活血化瘀；莪术（醋炙）、三棱（麸炒）破血行气，消积止痛；猪牙皂开窍散结；黄芩、大黄清热燥湿，泻下攻积；牵牛子、滑石利尿通淋，泻水通便，引药下行，诸药合用，共奏顺气宽胸、消积化滞之功效［2］。

中药及其制剂组成复杂，通过多成分、多靶点协同作用而达到治疗效果，单一成分检测难以全面评价其整体质量，多指标成分评价模式已逐步应用于相关质量控制中，但传统方法存在消耗大、检验成本高、部分对照品质量不稳定并难以获得等诸多不足。一测多评法利用中药有效成分间存在的内在函数关系，建立内标与其他成分之间的相对校正因子，仅使用1 种质量稳定、易于获得、价格低廉的对照品，实现对中药及其制剂中多指标成分含有量的同时测定，正成为质量评价新模式。本实验选择宽中顺气丸中君药香附（醋炙）所含香附烯酮、α-香附酮，臣药陈皮所含橙皮苷、川陈皮素、桔皮素，佐药莪术（醋炙）所含莪术二酮、莪术醇、吉马酮作为指标成分，建立一测多评法同时测定这8 种成分含有量，以期为完善和提高该制剂质量标准提供数据支持。

1 材料

Agilent 1100 型、Waters 2690 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；BP211DAG 型电子天平（德国Sartorius 公司）。吉马酮（批号111665-201605，纯度99.8%）、莪术二酮（批号111800-201302，纯度99.8%）、橙皮苷（批号110721-201818，纯度96.2%）、莪术醇（批号100185-201007，纯度99.9%）、α-香附酮（批号110748-201815，纯度99.7%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；桔皮素对照品（批号PRF8063048，纯度98.7%）购自成都普思生物科技股份有限公司；川陈皮素（批号18030541，纯度99.9%）、香附烯酮（批号18051522，纯度95.5%）对照品均购自上海同田生物技术股份有限公司；木香、陈皮、香附（醋炙）、三棱（麸炒）、莪术（醋炙）、五灵脂（醋炙）、猪牙皂、黄芩、牵牛子、大黄、滑石均购自永州市永靛中药饮片有限公司，经永州职业技术学院医学院王文渊教授鉴定为正品，按各药材质量标准检验均符合规定。宽中顺气丸（每100 粒重6 g，批号18080001、18080016、19010024）来源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为0.914、0.198、0.172、0.318、0.206、0.188、1.352、0.474 mg／mL 的贮备液，各精密吸取2.5 mL置于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（橙皮苷45.7 μg／mL、川陈皮素9.9 μg／mL、桔皮素8.6 μg／mL、莪术二酮15.9 μg／mL、莪术醇10.3 μg／mL、吉马酮9.4 μg／mL、香附烯酮67.6 μg／mL、α-香附酮23.7 μg／mL）。

2.1.2 供试品溶液 取丸剂适量，研细，精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，加热回流提取60 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例和工艺，分别制备缺陈皮、缺莪术、缺香附的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；检测波长326 nm（0～27.0 min，橙皮苷、川陈皮素、桔皮素）［3-5］、214 nm（27.0～45.0 min，莪术二酮、莪术醇、吉马酮）［6-9］、242 nm（45.0～70.0 min，香附烯酮、α-香附酮）［10-11］；柱温25 ℃；进样量10 μL。取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在上述色谱条件下进样测定，结果见图1，可知各成分与相邻色谱峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按照各成分色谱峰计均不低于5 000，阴性无干扰。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下对照品贮备液适量，甲醇制成25 倍质量浓度差的6 个对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮峰面积RSD分别为0.66%、0.94%、1.15%、1.02%、1.05%、1.23%、0.58%、0.72%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批丸剂，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮含有量RSD 分别为1.01%、0.67%、1.35%、1.29%、1.46%、1.78%、0.92%、1.17%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮峰面积RSD分别为0.59%、1.02%、1.18%、1.05%、1.12%、1.27%、0.53%、0.69%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批各成分含有量已知的丸剂适量，研细，精密称取9 份，每份1.0 g，随机分成3 组，每组3 份，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮质量浓度分别为 0.678、0.144、0.098、0.182、0.136、0.112、0.938、0.322 mg／mL ）0.5、1.0、1.5 mL，使目标成分加入量分别约为样品原有量的50%、100%、150%，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮平均加样回收率（RSD）分别为98.32%（1.32%）、97.87%（1.63%）、96.93%（1.20%）、98.87%（0.99%）、98.52%（0.81%）、99.74%（0.97%）、100.00%（1.03%）、99.03%（1.11%）。

2.4 相对校正因子测定 取“2.3.1”项下对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定，以吉马酮为内标，测定其他7 种成分相对校正因子fk／m，公式为fk／m＝fk／fm＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）（Wk为内标含有量，Ak为内标峰面积，Wm为待测成分含有量，Am为待测成分峰面积），结果见表3。

表3 各成分相对校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响 本实验考察了Waters 2690、Agilent 1100 色谱仪，以及Agilent TC-C18、Diamonsil C18、Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 不同体积流量对相对校正因子的影响 本实验考察了不同体积流量（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL／min）对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.3 不同柱温对相对校正因子的影响 本实验考察了不同柱温（20、22、25、27、30 ℃）对相对校正因子的影响，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

2.6 色谱峰定位 本实验以吉马酮为内标，采用相对保留时间法（待测成分与内标保留时间之比）对其他成分色谱峰进行定位，考察了“2.5.1”项下仪器、色谱柱对相对保留时间的影响，结果见表7，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

2.7 样品含有量测定 取3 批丸剂，按“2.1.3”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表8，可知2 种方法所得结 果接近［相对平均偏差（RAD）＜2.0%］。

表6 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表7 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.7 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表8 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 讨论

3.1 色谱峰定位方法确定 本实验曾采用保留时间差法对宽中顺气丸中各成分进行定位，但发现不同仪器、色谱柱下其保留时间差差异较大，难以对色谱峰进行准确定位；相对保留时间值法所得结果稳定，不同条件下其RSD 均小于2.0%，故最终确定采用该方法进行色谱峰。

3.2 流动相确定 本实验考察了乙腈-水［6］、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸［8］、乙腈-0.1% 冰醋酸［3-5，12］、甲醇-水［7，10-11，13-14］流动相体系，考察各成分峰形、分离度、色谱峰基线平稳情况，发现乙腈-0.1%冰醋酸洗脱时综合效果最佳，再对其不断进行改进优化，最终确定其作为流动相，此时各成分色谱图基线平稳，峰形对称，分离度符合规定。

4 结论

本实验首次建立一测多评法同时测定宽中顺气丸中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、莪术二酮、莪术醇、吉马酮、香附烯酮、α-香附酮的含有量，再通过方法学考察、相对校正因子耐用性试验、色谱峰定位、与外标法结果比较来验证其可行性。结果表明，该方法操作简便，结果准确，重复性好，可用于宽中顺气丸质量控制，为全面评价该制剂质量提供参考依据。