张志超，王小康，潘远安，刘江红

（深圳市龙华区中心医院药学部，广东 深圳 518110）

新补骨脂异黄酮是补骨脂Psoralea corylifolialL.中常见的黄酮类化合物［1］，有着抗氧化［2-3］、抗菌［3］、抗炎［4］、神经保护［5］、抗骨质疏松［6-7］、抗前列腺癌［8］等作用。课题组前期发现，补骨脂对大鼠具有很强的肝毒性和肾毒性，与文献［9-10］报道一致，故研究该药材所含新补骨脂异黄酮的体内药动学及组织分布时，有助于了解其体内代谢途径、组织蓄积情况、药理活性、毒性机制。

目前，对新补骨脂异黄酮的研究主要集中在大鼠给予补骨脂后它在血浆中的药动学和脑组织中的组织分布［11-13］，尚无单独给予该成分后的相关报道。因此，本实验在前期报道基础上，建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-MS／MS）法测定大鼠血清及各组织中新补骨脂异黄酮含有量，并研究该成分体内药动学和组织分布，为后期相关体内作用机制考察提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITYTMH-class 型超高效液相色谱仪、Waters SYNAPTTMG2 TQD 型三重四极杆串联质谱仪、MasslynxTM4.1 数据处理系统（美国Waters 公司）；Milli-Q 型超纯水系统（美国Millipore 公司）；QL-861 型微型旋涡混合仪（江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BP211D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Anke TGL-16G-A 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV-1800 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；DKZ-450B 型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）；MTN-2800D 型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 新补骨脂异黄酮对照品（纯度≥99%，批号SH-YY0908）购自上海一研生物科技有限公司；芒柄花黄素对照品（纯度≥98%，批号JD-65914）购自上海晶都生物技术有限公司。甲醇、乙腈、甲酸、水均为色谱纯；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物 SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（粤）-2018-0002，饲养于恒温［（25±2）℃］、恒湿［相对湿度（55±10）%］动物室，每天12 h亮／暗交替，自由饮水进食。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取新补骨脂异黄酮对照品适量，置于10 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成25.0 mg／mL 贮备液，甲醇再进一步稀释，即得（质量浓度分别为5.0、50.0、250.0、500.0 μg／mL），现配现用。

2.1.2 内标溶液 精密称取芒柄花黄素对照品适量，甲醇配制成50 μg／mL 贮备液，再用甲醇进一步稀释，即得（质量浓度为500 ng／mL），现配现用。

2.1.3 含药生理盐水 取适量新补骨脂异黄酮对照品，加适量生理盐水超声处理至溶解，即得（质量浓度为50 mg／mL），现配现用。

2.2 UPLC-MS／MS 分析

2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITYTMBEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相水（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～9.0 min，2%～36%B；9.0～10.5 min，36%～48% B；10.5～12.5 min，48%～80% B；12.5～13.5 min，80%～100% B；13.5～14.0 min，100%B；14.0～15.0 min，100%～2% B；15.0～16.0 min，2% B）；体积流量0.4 mL／min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.2.2 质谱条件 离子源ESI（正离子），毛细管电压3.3 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气、锥孔反吹气氮气，体积流量800、50 L／h；扫描方式多反应监测（MRM）；新补骨脂异黄酮检测离子m／z323.4～267.2，锥孔电压48 eV，碰撞能量20 eV；内标（芒柄花黄素）检测离子m／z269.1～253.1，碎裂电压50 eV，碰撞能量30 eV。

2.3 样本前处理 取组织样本1 g，加入3 mL 0.9%NaCl 溶液进行匀浆。取血清或组织匀浆样品100 μL，加入100 μL 500 ng／mL 内标（芒柄花黄素）溶液，充分混匀后加入300 μL 沉淀剂（乙腈）涡旋1 min，10 000 r／min 离心5 min，取上清液，氮气吹干，残渣用60%甲醇复溶，进行UPLCMS／MS 分析。

2.4 大鼠药动学、组织分布研究 取18 只SD 大鼠，随机分为3 组，每组6 只，实验前禁食12 h，并从颈外静脉抽取空白血液。3 组大鼠分别口服50、100、200 mg／kg 含药生理盐水后，于0.5、1、2、4、6、8、10、24、48 h 采集血液，置于EP 管中，室温下放置2 h 后10 000 r／min 离心10 min，吸取上层血清，于-80 ℃下保存。另取24 只SD 大鼠，随机分为4 组，每组6 只，随机选取1 组作为空白组，其余3 组口服100 mg／kg 含药生理盐水，分别于0.5、2、8 h 后腹腔注射水合氯醛麻醉，立即处死，取肾脏、肝脏、小肠，0.9%NaCl 溶液洗涤至无血色，滤纸吸干，置于EP 管中，液氮速冻15 min，于-80 ℃下保存。

2.5 数据处理 通过Winnonlin 6.3 软件进行分析，采用非房室模型计算主要药动学参数，其中tmax、t1／2、MRT0～t等参数经SPSS 软件进行组间统计学检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 专属性考察 取空白血清和组织、空白血清和组织+新补骨脂异黄酮或内标（芒柄花黄素）、给药0.5 h 后血清和组织，按“2.3”项下方法处理，在“2.2”项条件下进样测定，结果见图1～2。由此可知，新补骨脂异黄酮、内标色谱峰的峰形良好，内源性物质不干扰测定。

图1 大鼠血清和组织中新补骨脂异黄酮MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of neobavaisoflavone in rat serum and tissues

图2 大鼠血清和组织中内标（芒柄花黄素）MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of internal standard（formononetin）in rat serum and tissues

3.2 线性关系考察 取适量空白血清或空白组织匀浆液，加入“2.1.1”项下对照品溶液，制成含4.0、10.0、20.0、50.0、100.0、300.0、700.0 ng／mL新补骨脂异黄酮的相应样品溶液，按“2.3”项下方法处理（除了不加60%甲醇外），在“2.2”项条件下进样测定。以新补骨脂异黄酮质量浓度为横坐标（X），新补骨脂异黄酮与内标峰面积比值乘以内标溶液质量浓度的响应值为纵坐标（Y）进行回归，并以信噪比（S／N）＝10 为定量限，结果见表1，可知新补骨脂异黄酮在一定范围内线性关系良好，方法灵敏度较高，可用于微量分析。

表1 大鼠血清和组织中新补骨脂异黄酮线性关系Tab.1 Linear relationships of neobavaisoflavone in rat serum and tissues

3.3 基质效应、提取回收率试验 取5 只SD 大鼠空白血清、空白组织匀浆液各100 μL，按“2.3”项下方法处理（除了用甲醇代替内标溶液外），残渣用“2.1.1”项下12.5、25.0、450 ng／mL 对照品溶液各100 μL 溶解，平行5 份，氮气吹干后60%甲醇复溶，在“2.2”项条件下进样测定，得到峰面积A1；取相应质量浓度对照品溶液于EP 管中，加空白血清、空白组织匀浆液混匀，按“2.3”项下方法处理，平行5 份，在“2.2”项条件下进样测定，得到峰面积A2；取相应质量浓度的对照品溶液于EP 管中，氮气吹干后残渣用100 μL 纯水复溶，按“2.3”项下方法处理，在“2.2”项条件下进样测定，得到峰面积A3，以A1与A3的比值为基质效应，A2与A1的比值为提取回收率，结果见表2，可知该方法基质效应、提取回收率良好，符合生物样品检测要求。

表2 大鼠血清和组织中新补骨脂异黄酮基质效应、提取回收率试验结果（n＝5）Tab.2 Results of matrix effect and extraction recovery tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝5）

3.4 准确度、精密度试验 空白血清、空白组织匀浆液制成12.5、25.0、450.0 ng／mL 样品溶液，按“2.3”项下方法处理，平行6 份，在“2.2”项条件下进样测定5 d，结果见表3，可知该方法准确度、精密度良好，符合生物样品检测要求。

3.5 稳定性试验 空白血清、空白组织匀浆液制成12.5、450.0 ng／mL 样品溶液，按“2.3”项下方法处理，平行3 份，在“2.2”项条件下进样测定，分别考察经3 次冷冻-解冻循环、前处理后放置24 h、-80 ℃放置3 个月后的稳定性，结果见表4，可知该方法稳定性良好，符合生物样品检测要求。

3.6 药动学研究 大鼠口服给药后绘制血药浓度-时间曲线，再经非室模型统计矩计算主要药动学参数，见表5、图3。由此可知，100、200 mg／kg 新补骨脂异黄酮t1／2、tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞高于50 mg／kg（P＜0.05），以200 mg／kg 更明显（P＜0.05）。

表3 大鼠血清和组织中新补骨脂异黄酮准确度、精密度试验结果（n＝5）Tab.3 Results of accuracy and precision tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝5）

表4 大鼠血清和组织中新补骨脂异黄酮稳定性试验结果（n＝3）Tab.4 Results of stability tests for neobavaisoflavone in rat serum and tissues（n＝3）

表5 新补骨脂异黄酮主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for neobavaisoflavone（±s，n＝6）

表5 新补骨脂异黄酮主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for neobavaisoflavone（±s，n＝6）

注：与50 mg／kg 比较，∗P＜0.05；与100 mg／kg 比较，#P＜0.05。

图3 不同质量浓度新补骨脂异黄酮血药浓度-时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves for different concentrations of neobavaisoflavone

3.7 组织分布研究 大鼠口服给予新补骨脂异黄酮后，测定该成分在0.5、2、8 h 的组织分布，结果见图4。由此可知，不同时间点各组织中新补骨脂异黄酮含有量依次为肾＞肝＞小肠。

4 讨论

本实验采用UPLC-MS／MS 法，在16 min 内对新补骨脂异黄酮进行定量分析，具有快速灵敏、选择性好、专属性强的优点，可为研究该成分药动学及组织分布提供依据，也有利于阐明其作用机制。课题组前期采用文献［11］报道的LC-MS／MS 法测定血浆中新补骨脂异黄酮含有量，发现其流动相组成与本实验基本相同，均为乙腈-水等度洗脱，但该方法在检测组织样本时基线高，目标化合物响应低，故又在流动相中加入0.1%甲酸，可显著改善峰形，降低基线，提高响应值。

图4 大鼠组织中新补骨脂异黄酮含有量Fig.4 Neobavaisoflavone contents in rat tissues

结果显示，大鼠给予50 mg／kg 新补骨脂异黄酮后的药动学参数与给予100、200 mg／kg 比较具有显著差异，表明该成分在大鼠体内的吸收、分布、消除存在一定剂量依赖性，但不同剂量之间基本呈非线性关系。本实验选择中间剂量100 mg／kg，并以吸收相、分布相、消除相各1 个时间点为组织分布取样时间点，发现大鼠给药后新补骨脂异黄酮含有量在肾、肝中较高，维持时间较长，即在这2个部位存在药物蓄积现象，可能与补骨脂对大鼠具有肝毒性和肾毒性有关［14-15］。前期预实验发现，在大鼠心、脑、肌肉中未检测到新补骨脂异黄酮，推测该成分可能对组织分布具有一定的靶向性，需要作进一步研究。