张军华 黄 蓉 陈 赛 桂 嵘

（中南大学湘雅三医院输血科 长沙410000）

有研究发现骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell， BMMSC）和外周血受一定剂量的X 射线照射后，会造成细胞内DNA 损伤［1-2］。当DNA 损伤时，P53 表达量升高并被激活。根据DNA 损伤程度，P53 通过增强其下游多种基因的转录而引起细胞周期阻滞、凋亡或衰老，从而维持细胞基因组的完整性［3］。可见，P53通路是机体应对DNA损伤的天然防护屏障，然而目前P53发挥作用的上游调控机制尚不清楚。本研究将在国内外相关研究基础上，在BMMSC 内，通过circRNA 层面探讨P53 激活的上游机制，为P53 激活的上游信号调控网络打开一个全新的思路，丰富和完善P53通路调控BMMSC放射抗性的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

Balb/c 雌性小鼠BMMSC（上海中国科学院细胞库）；间充质干细胞（MSC）完全培养基（友康恒业生物科技（北京）有限公司）；胎牛血清（Gibco，美国）；mmu-circRNA-017122 和miRNA-29 引物（上海吉凯基因化学技术有限公司）；p53目的野生型基因序列和突变序列（上海吉凯基因化学技术有限公司）；荧光素酶报告基因野生型以及突变型载体和引物由上海生工生物工程有限公司合成；全自动凝胶成像分析仪（BIO-RAD，美国）；多功能酶标仪（BioTek，美国）；直线加速器（Varian Unique，美国）。

1.2 方法

1.2.1 吸收剂量对mmu-circRNA_017122的影响

BMMSC 浓度调整至2×106mL-1，接种于6 孔细胞培养板中，培养至细胞汇合率达80%左右时，将细胞分成5组，在直线加速器的X射线辐射场中进行照射处理，剂量率为0.4 Gy/min，源靶距100 cm，累积剂量分别为2 Gy、4 Gy、6 Gy 和8 Gy，对照组做遮挡处理，继续于细胞培养箱中培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h，qRT-PCR 检 测mmucircRNA_017122 和mmu-miR-29b-2-5p 的表达量，并用酶联免疫吸附（ELISA）检测P53 相对表达量。

1.2.2 生物学功能预测

分别利用TargetScan 和miRanda 预测mmucircRNA_017122 与miRNA 的结合位点，生成circRNA-miRNA 关系网络图，选取其中5 个匹配值最高的miRNA，利用KEGG 软件对其进行相关生物信息学分析。

1.2.3 荧光素酶报告基因实验

生物信息学软件预测mmu-circRNA_017122与mmu-miR-29b-2-5p 3′端 非 翻 译 区（3′untranslated region，3′UTR）的结合位点，设计合成包含mmucircRNA_017122 结 合 序 列 的mmu-miR-29b-2-5p 重组萤火虫荧光素酶报告质粒，将带有海肾荧光素酶基因的质粒（pRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒、mmu-circRNA_017122 mimic 和mmucircRNA_017122抑制剂共转染BMMSC，24 h后检测萤火虫荧光素酶（FL）和海肾荧光素酶（RL）的活性，根据FL/RL分析mmu-circRNA_017122与mmu-miR-29b-2-5p特异性结合。

1.2.4 RNA pull-down 试验验证mmu-miR-29b-2-5p与p53特异性结合

分别提取mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒转染组、空白对照组和mmu-miR-29b-2-5p 干扰组的BMMSC 中的总RNA。将200 pmol 生物素标记的p53与500 μg亲和素标记的磁珠混合温浴一段时间后，加入100 μg 上述总RNA 温浴。形成RNARNA 复合物，该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。将磁珠上结合的RNA 洗脱下来后，对mmu-miR-29b-2-5p进行实时荧光定量PCR定量检测。

1.2.5 mmu-miR-29b-2-5p调控P53的表达量

分别使用直线加速器照射mmu-miR-29b-2-5p腺病毒转染组、空白对照组和mmu-miR-29b-2-5p干扰组的BMMSC，吸收剂量为4 Gy，源靶距100 cm，吸收剂量率0.4 Gy/min。37°C、5%CO2继续培养，分别于照射后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h收取细胞，提取总RNA，检测mmu-miR-29b-2-5p和mmu-circRNA_017122表达量，并用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组BMMSC 内P53 的表达水平。

1.2.6 mmu-circRNA_017122 通 过 P53 参 与BMMSC辐照损伤修复

使用直线加速器分别对mmu-circRNA_017122腺病毒、空白腺病毒和siRNA-mmu-circRNA_017122 转染的p53 野生型和p53 缺失型BMMSC 及对照细胞以4 Gy 照射，源靶距100 cm，吸收剂量率0.4 Gy/min。37°C、5%CO2继续培养，分别于照射后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h收取细胞，检测P53的表达水平。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）测定法测量细胞增殖指数。每次待处理孔中加入10 μL CCK-8 溶液，置于37°C 恒温箱中2 h，然后置于酶标仪器上，于450 nm波长处测定各样本OD值，每个时间点对每组细胞测试5个孔。

2 统计分析

3 结果

3.1 吸收剂量对mmu-circRNA_017122的影响

辐照处理小鼠BMMSC 后，用qRT-PCR 分别检测于0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy 和8 Gy 处理组培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h 后mmumiR-29b-2-5p 和mmu-circRNA_017122 的 表 达 水平。结果显示，当吸收剂量为2 Gy、4 Gy 和6 Gy时，mmu-miR-29b-2-5p 表达无明显差异，mmucircRNA_017122 和P53 表达水平明显升高，且各组间具有显著差异，不同吸收剂量组培养不同时间后mmu-circRNA_017122 和P53 表达水平也有显著差异，8 Gy 组细胞在12 h 开始出现脱落死亡，mmu-circRNA_017122 和P53 表达水平改变不明显（图1）。

3.2 生物学功能预测

运用miRanda、TargetScan 软件，根据与目标序列上MREs 的miRNA 覆盖度，得到符合要求的ceRNA 关系对。将过滤后的ceRNA 按照其竞争结合的强弱进行排序，以网络图的形式展现circRNA-miRNA-mRNA 的 三 元 关 系。 使 用Cytoscape v 2.8.3 软件绘制ceRNA 关系网络图。可见mmu-circRNA_017122 与mmu-miR-29b-2-5p 之间的内源性竞争关系（ceRNA机制）（图2），具体结合位点见图3。

3.3 荧光素酶检测报告基因检测证实mmucircRNA_017122和mmu-miR-29b-2-5p特异性结合

采用荧光素酶活性检测mmu-circRNA_017122与mmu-miR-29b-2-5p 是否具有特异性结合，结果发现，mmu-circRNA_017122 模拟物与含有mmumiR-29b-2-5p序列的重组萤火虫荧光素酶报告质粒共同转染BMMSC，和空白对照组相比，荧光素酶活性强度明显降低，且差异具有统计学意义（p＜0.05）；mmu-circRNA_017122 siRNA干扰组与含有mmu-miR-29b-2-5p 序列的重组萤火虫荧光素酶报告质粒共同转染BMMSC，和空白对照组相比，共转染组BMMSC内荧光素酶强度活性明显增强，差异具有统计学意义（p＜0.05）（图4），这说明mmu-circRNA_017122 与mmu-miR-29b-2-5p 可 以特异性结合。

3.4 RNA pull-down 试验验证mmu-miR-29b-2-5p与p53特异性结合

实时荧光定量定量检测从磁珠上洗脱下来的mmu-miR-29b-2-5p，发现mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒转染组、空白对照组和mmu-miR-29b-2-5p 干扰组中mmu-miR-29b-2-5p 表达水平具有显著差异，具有统计学意义（p＜0.05）（图5）。

3.5 mmu-miR-29b-2-5p调控P53的表达量

mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒转染组、空白对照组和mmu-miR-29b-2-5p 干扰组的BMMSC 分别进行照射处理后，分别于6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h收取各组细胞，qRT-PCR和ELISA检测法分别检测各组BMMSC mmu-circRNA_017122 和P53 的表达水平。结果发现，mmu-circRNA_017122 表达量仅受辐照影响（图1（a）），mmumiR-29b-2-5p腺病毒转染组接受辐照处理后P53表达量比未接受辐照处理组下降更显著；而mmumiR-29b-2-5p 干扰组与对照组相比，P53 相对表达量升高更显著（图6）。

3.6 mmu-circRNA_017122 通 过 p53 参 与BMMSC辐照损伤修复

将 siRNA-mmu-circRNA_017122、 scramble siRNA、过表达重组mmu-circRNA_017122 腺病毒以及空白腺病毒分别转染p53野生型组和p53缺失型组BMMSC 后，分别在37°C 培养箱中培养24 h后，用ELISA 试剂盒检测各组细胞P53 表达水平，与p53 缺失型组比较，p53 野生型组过表达重组mmu-circRNA_017122 腺病毒转染BMMSC 后P53表达水平增加，而siRNA-mmu-circRNA_017122组细胞P53表达水平显著下降，具有统计学意义（图7）。同时将上述各处理组分别在37°C培养箱中培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h 后，通过CCK-8试剂盒检测各处理组在450 nm吸光光度值，分析其细胞增殖情况，发现p53 野生型组siRNAmmu-circRNA_017122 组细胞490 nm 吸光光度值显著降低，而过表达重组mmu-circRNA_017122腺病毒转染p53 野生型BMMSC 增殖明显，这说明mmu-circRNA_017122 通 过P53 参 与BMMSC 辐 照损伤修复，并促进细胞增殖（p＜0.05，图8）。

4 讨论

BMMSC 是造血微环境的重要组成部分［4-5］。其功能主要是分泌多种细胞因子调节造血干细胞增殖分化［6］，在造血干细胞移植术中，BMMSC是移植能否成功的关键因素。研究表明，BMMSC分泌黏附因子加快造血干细胞归巢［7］，并且支持内皮细胞增殖迁移，参与微血管形成［8］。有研究发现BMMSC与造血干细胞共移植可促进移植后的造血重建，使机体造血功能恢复明显加快［9］。

患者在造血干细胞移植前一般须进行全身辐照预处理，以清除病变造血干细胞。然而在此过程中，辐照也会对BMMSC 造成一定程度的损伤，导致部分受者移植后造血重建延迟，造血恢复缓慢，移植后感染等发生率增加，甚至可能导致移植失败［10］。因此，在造血干细胞移植前全身辐照预处理或放射治疗中，如何最大限度地保证BMMSC的数量和质量对骨髓损伤后的造血恢复意义重大［11］，增强BMMSC 的放射抗性是临床亟待解决的问题。

P53是细胞内的一个强大的转录因子，正常情况下，p53 基因及其相关网络处于关闭状态，当细胞在DNA 损伤时可被快速激活，通过增强其下游多种基因的转录而引起细胞周期阻滞、凋亡或衰老，保持细胞基因组的完整性并清除损伤细胞［12］。另外，P53与自噬的发生紧密相关，细胞放射损伤时P53 被激活，可使mTOR 抑制，自噬小体形成和LC3 脂化、断裂，引起自噬的发生［13］。可见，P53 介导的DNA 损伤反应的快速启动以及细胞自噬是BMMSC放射耐受的关键环节，对这一机制的深入研究可为细胞放射抵抗和放射耐受提供重要的信息。

已 有 研 究［14-16］表 明，miR-29 家 族 的3 个miRNA（miR-29a、miR-29b 和miR-29c）可促进P53的应激反应。我们前期通过circRNA芯片筛选到了mmu-circRNA_017122 在放射损伤的BMMSC中的异常表达，生物信息学技术预测该circRNA可与mmu-miR-29b-2-5p 配对结合，且初步使用siRNA 干扰技术证实沉默该circRNA 后mmu-miR-29b-2-5p 显著上调［17］。证实mmu-circRNA_017122与mmu-miR-29b-2-5p 之间的内源性竞争关系（ceRNA机制），利用miRanda和TargetScan算法进行ceRNA 分析得到circRNA-miRNA-mRNA 网络图，我们提出科学假设：BMMSC 中存在具有mmu-miR-29b-2-5p 应答元件的mmu-circRNA_017122，当BMMSC 遭受放射损伤时，mmucircRNA_017122 可通过“海绵作用”吸附mmumiR-29b-2-5p，调节P53的表达，从而参与DNA损伤反应或细胞自噬，影响BMMSC的放射抗性。

本研究通过荧光素酶检测报告基因检测证实mmu-circRNA_017122 和mmu-miR-29b-2-5p 特 异性结合，并利用RNA pull-down 试验验证mmumiR-29b-2-5p与P53特异性结合，利用不同剂量辐照处理BMMSC，并于不同时间点分别检测mmucircRNA_017122、P53 和细胞增殖情况，发现mmu-circRNA_017122、P53 和细胞增殖均受吸收剂量影响。进一步检测mmu-miR-29b-2-5p干扰组、mmu-circRNA_017122 干扰组和空白对照组中各相关指标检测和细胞增殖情况，检测结果发现，空白对照组BMMSC 内mmu-circRNA_017122 和P53的表达均显著升高，细胞增殖明显；mmu-miR-29b-2-5p干扰组较对照组P53显著升高，细胞明显增殖；mmu-circRNA_017122干扰组经4 Gy辐照处理后，P53虽有升高，但与对照组比较，升高值无明显统计学意义，细胞生长缓慢；P53过表达组细胞增殖显著。

综合上述，当BMMSC接受一定剂量的辐射处理时，胞内mmu-circRNA_017122 表达量显著上升，同时负性调控mmu-miR-29b-2-5p 对P53 表达的影响，从而促进BMMSC 增殖。这为深入研究BMMSC放射损伤的调控机制，进一步阐明放射生物学效应的分子机制，并为造血干细胞移植患者的辐照损伤防护和救治提供了新的药物靶点。