郑志伟，朱辉德，方玫玫，蔡晓锐，朱志伟，陈 蕾

食管癌是潮汕地区发病率最高的恶性肿瘤之一，调查研究显示[1]，2003年汕头大学医学院附属肿瘤医院住院患者前10位的疾病谱中，食管癌在住院病种中排名第一，而且其构成比比排名第二名的鼻咽癌高出7.9%，由此可见，食管癌仍较严重地威胁着当地居民身体健康。如何早期检查和发现食管癌患者，寻找食管癌的防治对策，成为困惑临床的一个关键问题。近年来血清中循环微小RNA(microRNA,miR)的研究逐步显示其作为生物标志物的潜能，外周血miRNAs可能是一种理想的肿瘤标志物，因其取材方便，显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性，可以应用于食管癌的早期诊断、治疗和预后的评估[2-3]。本研究选择了miR-21作为目标基因，通过实时荧光定量PCR检测miR-21在食管鳞癌中的表达，结合患者临床资料进行统计分析，探索及分析miR-21作为食管鳞癌诊断及预后标志物的潜力。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年10月—2017年6月汕头大学医学院附属肿瘤医院食管鳞癌患者50例和健康体检者50例。食管鳞癌患者均由本院取病理组织活检证实，其中男性38名，女性12名，年龄(57.28±8.42)岁。纳入病例标准：①符合食管鳞癌诊断标准；②确诊后在我院接受至少连续2次的辅助或新辅助化疗，且化疗前后已进行相关实验室检查；③有相关的影像学、内镜资料可进行肿瘤分期确定。正常对照组为50名性别、年龄相匹配的在本院健康体检中心进行体检的人员，对照组人员均接受血液学检查、胸片、腹部超声、大小便常规等检查，未发现任何异常。其中男性35名，女性15名，年龄(55.45±5.97)岁。所有受试者空腹静脉采血5 mL，12 500 r/min离心15 min，分离血清于-80 ℃冰箱保存备用。所有入选病例均详细采集性别、年龄、肿瘤位置、临床分期、淋巴结转移及远处器官转移情况、家族史、长期烟酒史资料。本研究经汕头大学医学院附属肿瘤医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要仪器和试剂 AvantiTM30低温高速离心机：美国Beckman公司；普通PCR仪：德国Eppendorf公司；Engine Opticon 2荧光定量仪：加拿大MJ Research公司；miR-21引物：苏州吉玛基因有限公司；miRNAs提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript逆转录试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；SYBR®Premix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 血清miRNAs提取 前期收集病例组与对照组血清样本，血清总miRNAs提取具体步骤参照TIANGENmiRcute miRNA提取分离试剂盒说明书，最后提取出血清总miRNAs溶解于30 μL RNase-FreeddH2O，-80 ℃冰箱保存待检测。

1.4 血清miR-21检测 使用TIANGEN逆转录试剂盒在所提取的miRNA 3′末端加上多聚A尾，即Poly(A)，再使用Oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物对miRNA进行逆转录反应，可生成对应的cDNA，接下来利用合成miR-21特异性引物，miR-21引物上游：5-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCG3′；下游:5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT-3′;使用美国Applied Biosystems公司ABI 7500PCR仪进行荧光定量检测，反应体系为20 μL。模式：94 ℃ 2 min，94℃ 20 s，60 ℃ 35 s，40个循环，最后一步做溶解曲线，设置为55～95 ℃，0.5 ℃/s，运行仪器，进行PCR扩增。反应完成后，记录下各反应管Ct值。若复孔间Ct值之差>1，需重复实验，取2复孔Ct值平均值进行统计分析。实时荧光定量PCR程序结束后，设定荧光阈值，设置的原则是要大于样本的荧光背景值(前15个循环信号)，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，使真正的信号是超过域值的荧光信号，从而得到各组PCR扩增反应的Ct值。取各miRNA的平均Ct值，采用参照基因△Ct法分析，以内在看家基因U6 snRNA表达Ct值作为内参标准，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平，计算公式为：2-(miRNAs-U6)。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者血清miR-21表达水平 食管癌患者血清中miR-21相对表达量为10.56±4.30，正常对照组血清中miR-21相对表达量为1.19±6.72，miR-21在食管鳞癌患者血清中表达水平明显高于健康人群，差异比较具有统计学意义(P<0.001)。

2.2 食管鳞癌患者血清中miR-21表达水平与临床病理特征之间的相关性 通过对不同性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期、烟酒史、家族史的食管鳞癌患者外周血miR-21表达水平进行对比分析，结果表明在食管鳞癌患者中，miR-21表达水平与肿瘤位置、TNM分期、是否发生淋巴结转移及远处器官转移具有显著的相关性。相对于胸上段的食管鳞癌患者，胸中、下段患者血清miR-21表达明显上调(P<0.05)；已发生淋巴结转移及远处转移的食管鳞癌患者血清miR-21表达水平明显高于其他患者(P<0.001)；临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表达水平较Ⅰ、Ⅱ期患者明显上调(P<0.05)。而miR-21的表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤家族史、烟酒史等无明显相关性(P>0.05)。表1。

表1 miR-21表达水平与临床病理特征之间的相关性

注：*P<0.05，△P<0.001

3 讨论

食管癌是我国的十大癌症之一，其死亡率在我国癌症总死亡率中占第四位[4]。据GLOBOCAN 2012数据显示，2012年度全世界67亿人口新发食管癌48.2万例，发病率为7.0/10万，居全部恶性肿瘤第9位；死亡40.7万例，死亡率5.8/10万，居第8位。中国大陆13.4亿人口食管癌新发25.9万例，发病率为16.7/10万，居全国各类恶性肿瘤第5位；死亡21.1万例，死亡率为13.4/10万，居第4位[5]。目前临床上大部分有临床症状的食管癌患者，就诊时病变已处于中晚期，失去早期治疗的机会，一般中晚期患者术后五年生存率仅为10%～30%，而早期食管鳞癌术后5年生存率则可达80%～90%[6]，因此，如何提高食管癌的早期诊断，尽早治疗对提高食管癌患者生存率具有重要意义。

MicroRNAs是一类高度保守的内源性单链非编码RNA，通过与靶基因3′端非编码区发生不完全配对，从而调节靶基因mRNA翻译、转录过程，参与转录后基因表达调控。miRNA在组织、细胞、外周血中的表达有显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性[7]，作为致癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展，有望成为新的生物标志物。我们通过文献的检索和前期实验研究[8-9],发现miR-21在多种肿瘤中均表达升高，基于提高特异性的考虑，我们联合选取miR-21作为候选检测的miRNA，以前人的研究作为基础，结合潮汕地区食管鳞癌高发的情况，通过检测血清miR-21在食管鳞癌患者中的表达，探讨miR-21表达在食管鳞癌中的临床意义。结果表明，miR-21在食管鳞癌患者血清中的表达水平较健康对照者均显著上调(P<0.001)，这一结果与上述基因在食管肿瘤组织与正常组织间表达失调的情况相符[10]，提示血清miR-21有作为食管鳞癌分子诊断标志物的潜力。本研究还发现，miR-21的表达水平还与食管鳞癌患者远处器官转移及淋巴结转移情况明显相关：食管鳞癌伴远处器官转移的患者血清miR-21表达水平分别是不伴远处转移患者的2.0倍(P<0.05)，而伴淋巴结转移的患者上述基因表达水平均为其他患者的1.6倍(P<0.05)。此外，不同临床分期的食管鳞癌患者血清miR-21的表达水平也呈现出明显的差异：临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的患者血清miR-21表达水平分别为Ⅰ、Ⅱ期患者的1.5倍(P<0.05)。研究结果表明miR-21具有成为食管鳞癌预后生物标志物的极大潜力。本研究还发现miR-21表达水平还与食管肿瘤的位置明显相关(P<0.05)，而不同位置的食管肿瘤治疗方法也不尽相同，解剖结构的特殊性使得胸上段食管鳞癌的患者手术治疗的可能性与胸中、下段肿瘤患者相比较小。因此，miR-21表达水平还可能对提示肿瘤位置、选择治疗方式具有参考意义。此外，本研究未发现miR-21的差异表达与年龄、性别、肿瘤家族史、长期烟酒史等因素有明确关联(P>0.05)。

本研究的样本仍然较少，在今后的工作中将进一步加大样本量，取得更可靠的实验结果，为食管癌的早期诊断找到有价值的血清指标，并进一步研究miR-21在食管鳞癌中的基因调控网络机制。