李凯琳，熊 佩，龚开妍，彭 婕，史思林，蔡 伟,2,3*

1湖南医药学院药学院；2新型抗体药物及其智能运输系统湖南省重点实验室；3侗医药研究湖南省重点实验室，怀化 418000

侗药马卡列丙Duhaldeanervosa是菊科旋覆花属显脉旋覆花的全草，分布于广西、云南、贵州等地，又有毛秀才、小黑药之称，具有祛风湿、通经络、消肿止痛的作用，主要用于风湿性关节炎、腰腿痛、骨折等病痛[1]。目前国内外关于马卡列丙的化学成分的系统研究较少，已分离得到的化学成分仅有57个，主要为挥发油类，甾体，和萜类等化学成分[2]，本课题组前期采用液质联用结合质谱树相似度过滤技术鉴定了47个绿原酸类成分[3]，其他成分鲜有报道。近年来，超高效液相色谱高分辨质谱联用仪，因其高分辨率，灵敏度和高分离度，被广泛的应用于食品，环境，药物等，尤其是中药中成分的定性分析。为了进一步深入的了解马卡列丙中未知的化学成分，本实验采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS结合离子排除列表，快速、有效、准确地对侗药马卡列丙中化学成分进行了分析鉴定，为侗药马卡列丙的质量控制和药效物质基础研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Q-Exactive Focus 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪与Dionex UltiMate 3000戴安高效液相色谱仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)，Mighty-10超纯水机(上海砾鼎水处理设备有限公司)，电子天平(福州华志科学仪器有限公司)。

1.2 实验材料

马卡列丙购自云南，经湖南医药学院汪冶教授鉴定为显脉旋覆花Duhaldeanervosa的根。色谱甲醇、乙腈(Macklin公司)、甲酸(赛默飞世尔科技有限公司)均为液质纯，其他试剂皆为分析纯。

柠康酸(批号 GE6650000)、4-羟基苯甲酸(批号 DH1925000)、水杨酸(批号 VO0525000)、没食子酸(批号 LW7525000)、顺式乌头酸(批号 20190512)、辛二酸(批号 20190620)、壬二酸(批号 CM1980000)、阿魏酸(批号 UD3365500)、十四烷二酸(批号 20190601)、脱落酸(批号 20190529)、间苯二甲酸(批号 NT2007000)均购自山东西亚化学股份有限公司；L-(-)-苹果酸(批号 M105695)、N-乙酰缬氨酸(批号 A109366)，4-香豆酸(批号 LotK1805057)、咖啡酸(批号 C108306)、柠檬酸(批号 C108869)、丁香酸(批号 S104156)均购自aladdin；酒石酸(批号 2018042074)购自天津致远化学试剂有限公司，以上纯度均大于98%。

2 试验方法

2.1 对照品溶液的制备

分别精确称取柠康酸、L-(-)-苹果酸、4-羟基苯甲酸、水杨酸、酒石酸、N-乙酰缬氨酸、4-香豆酸、间苯二甲酸、没食子酸、顺式乌头酸、辛二酸、咖啡酸、壬二酸、柠檬酸、阿魏酸、丁香酸、十四烷二酸、脱落酸适量，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，即得。

2.2 供试品溶液的制备

精确称取马卡列丙粉末50 g置于圆底烧瓶中，加入400 ml 50%乙醇溶液，回流提取两次，每次1 h，合并所得提取液，在50 ℃条件下减压浓缩后得浸膏，浸膏用适量的甲醇溶解，样品溶液经0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为2 μL，流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱：0～2 min，95%→90% A；2～5 min，90%→80% A；5～10 min，80%→70% A；10～12 min，75%→45% A；12～20 min，45%→20%A；20～25 min，20%→5% A;25～26 min，5%→95% A；26～30 min，95% A。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源，负离子模式下扫描，数据采用一级母离子全扫描和数据依赖性前三强二级子离子扫描并结合排除离子列表模式(Full Scan MS/dd-MS2/Exclusion list)，质谱扫描范围：m/z100～1 200；分辨率为35 000；喷雾电压为3 kV；鞘气压力为30 arb;辅助气压力为10 arb；毛细管温度为320 ℃；S-lens为50。

3 结果与分析

3.1 液质条件的优化

为了能获得更好的色谱峰型和分离度，本实验考察了不同的溶剂种类，如甲醇，乙腈，水等；不同的酸的不同浓度，如0.1%甲酸、0.05%甲酸、0.1%乙酸、0.05%乙酸等；不同的流动相梯度；不同的柱温；最终结果表明乙腈和0.1%甲酸水，在35 ℃时分离效果最合适。

常规的数据采集模式(Full Scan MS/dd-MS2)，对于共流出时的微量成分(强度非前三强的离子)，不能采集到二级数据，因此这类成分在用液质进行结构鉴定时，往往会造成丢失。为了解决微量成分的二级质谱数据采集问题，本实验建立了数据采用一级母离子全扫描和数据依赖性前三强二级子离子扫描并结合排除离子列表的数据采集模式。排除离子列表中的离子的来源有两方面，来源一为仪器本身的离子干扰，具体方法为，进空白溶液，从空白溶液中，选择离子响应强度前100强的离子，导入排除离子列表。来源二为本课题组前期从该植物中已鉴定的化合物，主要为绿原酸类成分。使用该方法，可以采集到更多微量未知成分的二级质谱数据，用于成分的结构解析。

3.2 样品中成分的鉴定

通过对照品，参考文献和数据库，从侗药马卡列丙中共鉴定了40个化学成分，其高分辨提取离子流图如图1所示，各化学成分的保留时间，准分子离子峰的质荷比的理论值和实测值，碎片离子等数据，如表1所示。

图1 马卡列丙提取物在负离子模式下的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS提取离子流图Fig.1 The extract ion chromatogram of in negative ion mode of extract from D.nervosa using UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

表1 马卡列丙中化学成分鉴定结果

续表1(Continued Tab.1)

序号No.tR(min)理论值Theoretical mass 实际值Experimental mass 误差Error(ppm)分子式Formula[M-H]-裂解碎片MS/MS fragment鉴定结果Identification result50.99145.014 25145.013 06-4.40C5H5O5MS2[145]:101.023 1(100),127.024 0(27),83.012 5(27),126.018 4(21),57.033 2(17)2-氧戊二酸60.99173.009 16173.008 21-2.33C6H5O6MS2[173]:111.007 5(100),85.028 1(16)反式乌头酸71.11133.014 25133.013 05-4.87C4H5O5MS2[133]:115.002 3(100),71.012 4(43)D-(+)-苹果酸81.24173.009 16173.008 13-2.79C6H5O6MS2[173]:85.028 1(100),111.007 4(29),129.018 1(25)顺式乌头酸91.26188.056 46188.055 57-4.71C7H10O5NMS2[188]:128.034 1(100),102.054 7(66),144.065 5(38),59.012 5(35),170.044 9(29)N-乙酰-谷氨酸101.42147.066 28147.065 17-3.83C6H11O4MS2[147]:129.054 5(100),101.059 4(58),59.012 4(36)甲羟戊酸111.56169.014 25169.013 28-2.47C7H5O5MS2[169]:125.023 2(100)没食子酸121.69129.019 33129.018 17-0.07C5H5O4MS2[129]:85.028 1(100),72.991 7(55),83.048 8(24),128.034 0(18)柠康酸132.08191.056 11191.055 21-4.72C7H11O6MS2[191]:101.059 4(100),115.038 8(42),129.054 5(42),145.049 4(13),72.991 7(10)D-(-)-奎宁酸142.50218.103 40218.102 74-3.01C9H16O5NMS2[218]:88.039 0(100),146.081 1(52)泛酸152.82153.019 33153.018 26-3.42C7H5O4MS2[153]:109.028 2(100)原儿茶酸163.42151.040 07151.038 96-7.33C8H7O3MS2[151]:121.064 5(100),107.048 9(79),123.043 8(68)2-羟基苯乙酸173.47375.129 67375.129 49-0.48C16H23O10MS2[375]:151.075 2(100),146.986 3(99),213.076 3(57),169.085 9(53),125.059 5(50),107.049 0(30),101.022 9(29)Mussaenosidic acid183.59158.082 27158.081 16-3.53C7H12O3NMS2[158]:116.0704(100),130.9824(24)N-乙酰缬氨酸193.63203.082 60203.081 88-3.55C11H11O2N2MS2[203]:116.049 2(100),74.023 3(38),72.007 7(32),142.065 0(27),159.091 8(21)色氨酸204.17137.024 42137.023 28-8.30C7H5O3MS2[137]:93.033 1(100)4-羟基苯甲酸214.34175.061 20175.060 24-2.33C7H11O5MS2[175]:115.038 7(100),113.059 4(38),85.064 5(33)2-异丙基苹果酸224.37164.071 70164.070 60-3.37C9H10O2NMS2[164]:147.044 0(100),72.007 7(22)苯丙氨酸234.92181.050 63181.049 73-1.95C9H9O4MS2[181]:135.493 9(100),163.039 0(63),136.982 3(29),119.043 9(11)4-羟基苯乳酸245.03179.034 98179.033 98-2.53C9H7O4MS2[179]:135.043 9(100)咖啡酸255.33197.045 55197.044 69-4.35C9H9O5MS2[197]:182.021 0(100),153.054 3(23)丁香酸265.59131.071 37131.070 22-4.57C6 H11O3MS2[131]:85.064 5(100)2-羟基己酸275.75131.071 37131.070 16-5.03C6 H11O3MS2[131]:85.064 5(100)2-羟基己酸285.85165.019 33165.018 23-6.68C8H5O4MS2[165]:121.027 9(100)间苯二甲酸296.41163.040 07163.039 05-2.88C9 H7O3MS2[163]:119.048 9(100),120.052 2(6)4-香豆酸306.53165.055 72165.054 72-2.72C9H9O3MS2[165]:121.064 6(100),147.043 9(25)3-(4-羟基苯基)丙酸

续表1(Continued Tab.1)

序号No.tR(min)理论值Theoretical mass 实际值Experimental mass 误差Error(ppm)分子式Formula[M-H]-裂解碎片MS/MS fragment鉴定结果Identification result316.77165.055 72165.054 69-2.90C9H9O3MS2[165]:121.064 6(100),106.041 1(19)3-(4-羟基苯基)丙酸326.79173.081 93173.080 93-2.62C8H13O4MS2[173]:111.080 2(100),146.986 3(58)辛二酸336.87174.056 05174.055 07-2.49C10H8O2NMS2[174]:146.960 1(100),130.065 0(80),111.080 2(60)吲哚-3-乙酸347.02193.050 63193.049 82-4.21C10H9O4MS2[193]:178.026 1(100),134.036 1(86), 149.059 6(42),137.023 1(16)阿魏酸358.41137.024 42137.023 27-8.37C7H5O3MS2[137]:93.033 4(100)水杨酸368.71187.097 58187.096 59-5.30C9H15O4MS2[187]:125.095 9(100),146.986 3(52)壬二酸3710.93263.128 88263.128 85-0.12C15H19O4MS2[263]:219.138 4(100),201.127 6(65),151.075 3(46),152.083 0(32),139.075 1(22)脱落酸3811.61201.113 23201.112 35-4.39C10H17O4MS2[201]:139.111 6(100),183.101 7(77),146.986 3(51)3-叔丁基丙酸3913.99187.133 97187.133 15-4.37C10H19O3MS2[187]:59.012 4(100),146.986 3(22)10-羟基癸酸4014.58257.175 83257.175 72-0.44C14H25O4MS2[257]:239.164 9(100),195.174 7(39)十四烷二酸

3.3 化学成分鉴定

化合物2～4、8、11～12、18、20、24～25、28～29、32、34～37和40的保留时间分别为0.95、0.96、0.97、1.24、1.56、1.69、3.59、4.17、5.03、5.33、5.85、6.41、6.79、7.02、8.41、8.71、10.93、14.58 min，通过与对照品的保留时间，高分辨质谱，碎片离子比对，准确鉴定为酒石酸、L-(-)-苹果酸、柠檬酸、顺式乌头酸、没食子酸、柠康酸、N-乙酰缬氨酸、4-羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、间苯二甲酸、4-香豆酸、辛二酸、阿魏酸、水杨酸、壬二酸、脱落酸、十四烷二酸。

化合物6和7分别与化合物8(顺式乌头酸)和化合物3(L-(-)-苹果酸)具有相同的一级和二级质谱信息，因此将化合物6和7分别鉴定为反式乌头酸和D-(+)-苹果酸。

化合物1的准分子离子峰为[M-H]-m/z195.050 05(C6H11O7，5.00 ppm),二级碎片离子为75.007 3、129.018 1、99.007 5、87.002 4，结合文献报道[4]，鉴定为葡萄糖醛酸；化合物5的保留时间为0.99 min，其分子式[M-H]-为C5H5O5(145.013 06，-4.40 ppm)，二级碎片为101.023 1、127.024 0、83.012 5，根据文献报道[5]，鉴定为2-氧戊二酸。

化合物9、19和22的准分子离子峰分别为m/z188.055 57、203.081 88和164.070 60 [M-H]-，通过与Thermo内置的数据库比对，分别鉴定为N-乙酰谷氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。

化合物10的准分子离子峰为m/z147.065 17[M-H]-，二级碎片离子为m/z129.054 5、101.059 4、59.012 4，并结合文献报道[6]，鉴定为甲羟戊酸。

化合物13的准分子离子峰为m/z191.055 21[M-H]-，产生了m/z101.059 4、115.038 8、129.054 5和145.049 4的二级碎片离子，根据文献报道[7]，鉴定为D-(-)-奎宁酸。

化合物14的保留时间为2.50 min，准分子离子峰为m/z218.102 74[M-H]-，二级碎片为m/z88.039 0和146.081 1，结合文献[8]，鉴定为泛酸。

化合物15的准分子离子峰为m/z153.018 26[M-H]-，通过丢失CO2，形成m/z109.028 2的二级碎片离子，结合文献报道[9]，鉴定为原儿茶酸。

化合物16的保留时间为3.42 min，产生m/z151.038 96[M-H]-的准分子离子和m/z121.064 5、107.048 9、123.043 8的二级碎片离子，根据文献报道[10]，鉴定为2-羟基苯乙酸。

化合物17的保留时间为3.47 min，产生了m/z375.129 49[M-H]-的准分子离子峰,以375.129 49[M-H]-为母离子，在其二级质谱图中，碎片离子m/z213.075 9是由中性丢失1分子葡萄糖基([M-H-Glc]-)生成的,基峰碎片离子m/z169.085 9对应[M-H-Glc-CO2]-,结合文献[11]，鉴定为mussaenosidic acid。

化合物21的保留时间为4.34 min，准分子离子峰为m/z175.060 24[M-H]-，产生了m/z115.038 7的二级碎片离子，结合文献报道[12]，鉴定为2-异丙基苹果酸。

化合物23的保留时间为4.92 min，产生m/z181.049 73[M-H]-准分子离子峰和m/z135.493 9和163.039 0的二级碎片离子，并结合文献报道[13]，鉴定为4-羟基苯乳酸。

化合物26和27的出峰时间为5.59和5.75 min，均得到m/z131.071 37[M-H]-的准分子离子峰，且具有相同的二级碎片离子m/z85.064 5，根据文献报道[13]，鉴定为2-羟基己酸的同分异构体。

化合物30和31的保留时间分别为6.53和6.77 min，均得到m/z165.054 7[M-H]-的质谱信号和二级碎片离子m/z121.064 6，结合文献[14]，鉴定为3-(4-羟基苯基)丙酸的同分异构体。

化合物33的准分子离子峰为m/z174.055 07[M-H]-，碎片离子为m/z135.043 9，结合文献报道[15]，鉴定为吲哚-3-乙酸。

化合物38的保留时间为11.61 min，产生了m/z201.112 35[M-H]-的准分子离子峰和m/z139.111 6、183.101 7、146.986 3的二级碎片离子，结合文献[16]，鉴定为3-叔丁基丙酸。

化合物39的保留时间为13.99 min，准分子离子为m/z187.133 15[M-H]-，二级碎片离子为m/z59.012 4和146.986 3，根据文献报道[17]，鉴定为10-羟基癸酸。

4 讨论

本实验首次采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS结合排除离子列表研究了侗药马卡列丙中的化学成分。排除离子列表可以很好的排除仪器中背景离子和已鉴定的化合物离子的干扰，从而产生更多有用的二级质谱数据，进而可以首次从该植物中鉴定更多未报道的化合物。本实验从侗药马卡列丙中鉴定了40个化学成分，均是从该植物中首次发现。侗药马卡列丙具有祛风湿、通经络、消肿止痛的传统功效，现代药理研究表明其主要活性为抗炎、镇痛和抗氧化。相关研究表明，马卡列丙中分离得到的麝香草酚、异丁酸百里香酯和绿原酸类成分具有明显的抗炎和镇痛作用[3,18]。本研究首次从马卡列丙中鉴定出的咖啡酸、没食子酸、水杨酸、奎尼酸、原儿茶酸和香豆酸等化学成分拥有较强的抗炎活性[19,20]；酒石酸、苹果酸、柠檬酸、原儿茶酸和阿魏酸等具有较好的抗菌和抗氧化作用[21,22]。该结果为阐明马卡列丙中抗炎和抗氧化的化学物质奠定基础，后续仍需进一步进行网络药理学和实验研究来验证其药效物质。与此同时，排除离子列表在液质成分鉴定的应用，极大地促进了中药中化学成分的首次发现。