颜凤霞，李孝绒，田 凡，王莲辉*

1贵州省林业科学研究院，贵阳550005；2贵州大学生命科学学院，贵阳 550025

西藏虎头兰(CymbidiumtracyanumL.)属于兰科兰属附生型多年生草本植物，其花器官主要分为合蕊柱、唇瓣、花瓣(如图1)，是兰属植物中重要的观赏花卉之一，具有很高的观赏价值和经济价值[1,2]，其在中国主要分布于贵州西南部、云南西南部至东南部、西藏东南部、缅甸和泰国等海拔1 200～1 900 m 的林中树干或分枝上[3]。花香是由各种芳香成分共同作用而形成的，实质是一类低分子量、低沸点、低极性的、具挥发性的小分子混合物，是构成和影响花卉观赏价值的主要因素之一，香花育种一直是重要的育种目标[4]，目前在兰属春兰、大花蕙兰、建兰、鼓槌石斛、铁皮石斛等花卉中已有香气成分的研究报道[5-8]。但目前未见西藏虎头兰花香挥发性成分和相对含量的日动态变化分析、花器官不同部位花香挥发性成分和相对含量分析的研究报道。固相微萃取技术(SPME)是一种新型无溶剂样品预处理技术，它通过吸附/脱吸附技术，富集样品中的挥发性和半挥发性成分，具有无需有机溶剂、所需样品量少、灵敏度高、操作简单、方便快捷等特点[9]。SPME与GC-MS技术联用，集采样、萃取、浓缩、进样为一体，大大提高了分析速度和方法的灵敏度，这项技术已广泛应用于花卉[10-13]、食品[14,15]等的挥发性成分检测。

本研究中以西藏虎头兰为试验材料，利用SPME结合GC-MS技术分析鉴定其盛花期花香成分、含量日变化规律及花器官不同部位花香挥发性成分和相对含量，以探索西藏虎头兰的特征香气来源，为兰属植物中其他兰属植物香气形成机制研究提供参考。

图1 西藏虎头兰及其花器官解剖图 Fig.1 C.Tracyanum and anatomical map of C.Tracyanum

1 材料与仪器

材料来源于贵州省林科院五年生组培苗开花的西藏虎头兰，花期9～12月，开花时长30～40天。

所用采样及分析仪器：手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)，萃取纤维为；2 cm-50/30 μm

DVB/CAR/PDMS Stable Flex。HP6890/5975C气相-质谱联用仪(美国安捷伦公司)。

2 方法

2.1 取样方法

选择处于盛花期(开花第7天)生长势一致、开花正常的6株西藏虎头兰作为采集对象，进行花香成分测定。分别在10∶00、14∶00及18∶00取西藏虎头兰整朵花测定其花香成分，进行花香成分日变化动态监测；解剖西藏虎头兰花，并测定花瓣、唇瓣和蕊柱三个花器官的花香成分。

花香分析采用手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)：取混匀样品1.5 g，置于50 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纤维头的手动进样器，在50℃的平板加热条件下顶空萃取45 min时间后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中，热解析5 min进样。

2.2 分析条件

色谱柱为FB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温40 ℃(保留2 min)，以2.5 ℃/min升温至160 ℃，再以15 ℃/min升温至280 ℃，运行时间：58 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压6.88 psi，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1 min。

离子源为EI源，温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 800 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。

2.3 定性定量分析

对总离子流图中的各峰经质谱用计算机数据系统检索及核对Nist 14和Wiley275中标准质谱图，确定挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定西藏虎头兰鲜花活体花香各化学成分的相对质量分数及其相对含量。

3 结果与分析

3.1 西藏虎头兰盛花期花香日变化规律分析

经GC-MS分析西藏虎头花盛花期10∶00、14∶00和18∶00这3个时间点花香释放的总离子流图(图2)，扣除本底杂质后，从西藏虎头花盛花期花朵释放的花香中共鉴定出挥发性成分89种。

从表1可以看出，在西藏虎头兰10点时，鉴定出挥发性成分88种，其中萜烯类化合物最多26种，百分含量最大，占到总量的46.821%，其次为醇类14.540%、醛类7.057%、酚类11.01%、酮类6.676%、呋喃类2.255%、醚类1.90%和芳香族化合物1.18%等；主要化学物质依次是化合物α-蒎烯，松萜占最大16.33%，桧烯4.46%、β-蒎烯6.37%、DL-柠檬烯5.98%、对甲酚9.49%等。14点时，鉴定出挥发性成分87种，其中萜烯类化合物最多25种，百分含量最大占到总量的57.121%，其次为醇类9.473%、醛类5.294%和酚类14.189%等；主要化学物质依次是α-蒎烯，松萜占最大18.813%，香桧烯5.898%、β-蒎烯7.481%、DL-柠檬烯8.547%、α-松油烯5.544%、对甲酚13.858%等。在18点时，鉴定出挥发性成分83种，其中萜烯类化合物最多24种，百分含量最大占到总量的45.83%，其次为醇类13.128%、醛类9.629%和酚类16.039%等；主要化学物质依次是对甲酚占最大15.932%，α-蒎烯，松萜占15.317%、桧烯3.977%、β-蒎烯6.156%、DL-柠檬烯5.971%、α-松油烯3.254%等。

图2 西藏虎头兰盛花期日变化花香成分总离子流图Fig.2 Total ion current chromatogram of aromatic constituents from C.tracyanum of diurnal variation注：A∶10∶00；B∶14∶00；C∶18∶00。

表1 西藏虎头兰日变化花香成分种类及相对含量

续表1(Continued Tab.1)

类型Type化合物Compound保留时间tR(min)相对含量 Relative content10∶0014∶0018∶00萜烯类Terpene1,3-戊二烯 1,3-Pentadiene1.8610.010.0550.0472-丁烯 2-Butenone2.1820.020.0190.013(Z)-3-甲基-1,3-戊二烯 (Z)-3-Methyl-1,3-pentadiene2.6220.070.0750.028三环烯,三环萜 Tricyclene10.6250.010.0120.008α-崖柏烯 α-Thujene10.9742.202.7092.133α-蒎烯松萜 α-Pipene11.35816.3318.81315.317莰烯 Camphene11.9560.120.1210.069桧烯 Sabinene13.4664.465.8983.977β-蒎烯 β-Pinene13.5276.377.4816.156β-月桂烯 β-Myrcene14.4310.521.0621.779α-水芹烯 α-Phellandrene15.0510.210.2770.598α-松油烯 α-Terpinene15.7250.610.7510.647对伞花烃 p-Cymene16.2570.210.2620.33DL-柠檬烯 DL-Limonene16.495.988.5475.9713-乙基-2-甲基-1,3-己二烯3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadiene16.5951.440.9852.402γ-松油烯 γ-Terpinene18.1581.241.5341.012反式桧烯水合物 trans-Sabinene hydrate18.8720.180.1310.175α-松油烯 α-terpinolene19.843.515.5443.254对聚伞花烯 p-Cymenene20.040.160.1250.021,3,8-p-孟三烯1,3,8-p-Menthatriene21.2160.220.148-反式-柠檬烯氧化物 trans-Limonene oxide22.7130.14--δ-榄香烯 δ-Elemene33.5110.020.0450.031β-榄香烯 β-Elemene36.4050.400.4050.316(E)-β-法呢烯 (E)-β-Famesene39.6740.030.0370.02瓦伦烯 Valencene41.1341.381.1730.844α-芹子烯 α-Selinene41.5390.980.9120.683合计 Total46.821 57.12145.83酮类Ketone2-丁酮 2-Butanone 2.2330.060.090.0351-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one3.1510.000.030.0053-戊酮 3-Pentanone3.3440.840.8760.8973辛酮 3-Octanone14.190.720.4660.626-甲基-5-庚烯-2-酮 6-Methyl-5-hepten-2-one14.2380.670.9181.455马鞭草烯酮 Verbenone26.8423.521.6910.709香叶基丙酮 Geranyl acetone39.5240.040.0360.018六氢呋喃丙酮 Hexahydrofarnesyl acetone53.6280.010.0070.0032-己烷酮 2-Heptadecanone54.3430.820.3410.371合计 Total6.676 4.4554.113酯类Ester乙酸甲酯 Methyl acetate1.8730.030.0070.028壬内酯 Nonlacton35.2520.140.0530.071

续表1(Continued Tab.1)

类型Type化合物Compound保留时间tR(min)相对含量 Relative content10∶0014∶0018∶00棕榈酸甲酯 Methyl palmitate54.5810.020.020.025合计 Total0.19 0.080.124酚类Phenol愈创木酚 Guaiacol20.4670.340.194-对甲酚 p-Cresol21.6849.4913.85815.932对-甲氧甲酚 p-Creosol26.3191.180.1370.107合计 Total11.01 14.18916.039呋喃类Furan2-甲基呋喃 2-Methylfuran2.2830.010.0080.012-乙基呋喃 2-Ethylfuran3.4160.020.0510.1022,4-二甲基呋喃 2,4-Dimethylfuran3.6550.010.0280.0192-丁基呋喃 2-Butylfuran9.3790.080.0810.1242-戊基呋喃 2-Pentylfuran14.472.131.9052.57合计 Total2.255 2.0732.825醚类Ether对甲基苯甲醚 p-Methylanisole16.1571.52 0.8310.642藜芦醚 Veratrol23.5660.38 0.4430.139合计Total1.90 1.2740.781芳香族化合物Aromatic3,4-二甲氧基甲苯 3,4-Dimethoxytoluene28.7030.290.038-3,5-二甲氧基甲苯 3,5-Dimethoxytoluene30.1470.890.3740.938合计 Total1.18 0.4120.938烷烃类Alkane十四烷 Tetradecane36.8260.030.009-十六烷 Hexadecane46.4510.020.010.007(正)十七(碳)烷 Heptadecane50.8040.030.023-合计 Total0.08 0.0420.007

注：“-”表示未检测到或不存在。

Note:“-” means that it is not detected or does not exist.

3.2 西藏虎头兰不同花器官花香变化规律分析

图3为西藏虎头花盛花期不同花器官花香释放的总离子流图，扣除本底杂质后，从西藏虎头花盛花期花瓣、唇瓣及合蕊柱释放的花香中共鉴定出挥发性成分86种(表2)，由萜烯类、醇类、醛类、酮类、酯类、芳香族类、烷烃类、醚类、呋喃类、酚类十大类组成。

从表2可以看出，西藏虎头兰花香挥发性成分在花瓣中72种、唇瓣中66种及合蕊柱中62种，由花瓣到唇瓣到合蕊柱呈递减过程。花瓣中，萜烯类化合物最多22种，相对含量最大占到总量的64.223%，其次为醇类9.147%、酮类5.19%、酚类9.573%、醛类2.512%、呋喃类0.15%、烷烃类0.06%、酯类0.123%、醚类0.331%和芳香族化合物0.546%；主要化学物质是α-蒎烯，松萜占比30.242%最大，其次β-蒎烯12.502%、对甲酚9.53%、桧烯6.049%、DL-柠檬烯6.081%等。唇瓣中，也是萜烯类化合物最多18种，百分含量最大占到总量的43.854%，其次为醇类12.063%、醛类8.685%、酚类16.928%、酮类5.648%、呋喃类3.652%、烷烃类0.032%、醚类0.869%、酯类0.107%和芳香族化合物0.145%；主要化学物质是对甲酚占比最大16.172%，其次α-蒎烯，松萜3.103%、α-松油烯15.160%、1-己醇4.975%和DL-柠檬烯11.613%等。合蕊柱中，萜烯类、醛类及醇类化合物最多，都为14种，百分含量分别为10.851%、16.504%、26.699%，酮类4.842%、烷烃类0.086%、酯类0.09%、醚类1.282%、呋喃类3.934%及芳香族化合物0.271%；主要化学物质依次是对甲酚占比最26.804%，己醛5.264%、1-己醇15.747%，(E)-2-辛烯醛4.606%、而α-蒎烯，松萜百分含量降低到0.582%。

图3 西藏虎头兰不同花器官花香成分总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of aroma components of different floral organs of C.tracyanum注：A：花瓣；B：唇瓣；C：合蕊柱。Note:A:Petal;B:Labellun;C:Gynandrium.

表2 西藏虎头兰花不同器官花香成分及相对含量

续表2(Continued Tab.2)

类型Type化合物Compound保留时间tR(min)相对含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium(E)-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal7.9930.010.0730.328庚醛 Heptanal9.8460.0180.2950.633(E)-2-庚烯醛 (E)-2-Heptenal12.6730.0490.3911.040辛醛 Octanal15.0870.1790.5741.633苯基乙醛 Phenylethanal17.6230.0540.2270.216(E)-2-辛烯醛 (E)-2-Octenal18.2470.1771.6534.606壬醛 Nonanal20.8310.2231.4970.645β-半环柠檬醛 β-Cyclocitral27.2470.2680.0550.051合计 Total2.5128.68516.504萜烯类 Terpene1,3-戊二烯 1,3-Pentadiene1.8510.0020.0440.0092-丁烯 2-Butenone2.1720.0350.0050.005三环烯,三环萜 Tricyclene10.6270.014--α-崖柏烯 α-Thujene10.9652.8891.1930.358α-蒎烯,松萜 α-Pipene11.31830.2423.1030.582莰烯 Camphene11.9740.1--桧烯 Sabinene13.4146.0492.2050.461β-蒎烯 β-Pinene13.50412.5020.7590.461β-月桂烯 β-Myrcene14.4210.8710.943-α-水芹烯 α-Phellandrene15.0580.3670.341-α-松油烯 α-Terpinene15.7320.4791.0570.368对伞花烃 p-Cymene16.2190.1551.1610.474DL-柠檬烯 DL-Limonene16.4466.08111.6131.8893-乙基-2-甲基-1,3-己二烯 3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadiene16.5570.4352.6403.756γ-松油烯 γ-Terpinene18.160.7112.5200.394反式桧烯水合物 trans-Sabinene hydrate18.8640.1710.236-α-松油烯 α-terpinolene19.8010.71815.1602.023对聚伞花烯 trans-Sabinene hydrate20.063-0.402-1,3,8-P-孟三烯 p-Cymenene21.242-0.3280.056反式-柠檬烯氧化物 trans-Limonene oxide22.712-0.144-δ-榄香烯 δ-Elemene33.5040.041--β-榄香烯 β-Elemene36.3990.356--(E)-β-法呢烯 (E)-β-Famesene39.6760.041--瓦伦烯 Valencene41.121.078--α-芹子烯 α-Selinene41.5230.886-0.015合计64.22343.85410.851醇类Alcohol乙醇 Ethanol1.6640.3530.4071.265丙醇 Propanol2.042-0.0090.0071-戊烯-3-醇 1-Penten-3-ol3.2170.1260.4070.455

续表2(Continued Tab.2)

类型Type化合物Compound保留时间tR(min)相对含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium3-甲基-1-丁醇 3-Methyl-1-butanol4.2190.0130.0140.0391-戊醇 1-Pentanol5.0420.2431.0461.189(Z)-2-戊烯醇 (Z)-2-Pentenol5.1860.1390.7330.897顺式-3-己烯醇 cis-3-Hexenol8.1290.3291.2481.8941-己醇 1-Hexanol8.7131.1774.97515.747(E)-2-辛烯醇 (E)-2-Octenol19.263-1.0240.933辛醇 Octanol19.3550.1970.7572.773芳樟醇 Linalool20.8641.162--苯乙醇 Benzeneethanol22.120.5720.8501.1184-萜品醇 4-Terpineol25.1160.2760.5770.343丁香醇A Lilac alcohol A27.0951.729--榄香醇 Elemol44.3971.599-0.011反式橙花叔醇 trans-Nerolidol44.9860.248--γ-桉叶醇 γ-Eudesmol48.120.125--β-桉叶醇 β-Eudesmol49.0370.3330.0160.028α-桉叶醇 α-Eudesmol49.1290.526--合计 Total9.14712.06326.699酮类 Ketone2-丁酮 2-Butanone 2.2230.2580.0060.0071-戊烯-3-酮 1-Penten-3-one3.1960.0220.0560.3033-戊酮 3-Pentanone3.3420.6461.8991.9903辛酮 3-Octanone14.2110.263.5662.3156-甲基-5-庚烯-2-酮 6-Methyl-5-hepten-2-one14.2520.761--马鞭草烯酮 Verbenone26.6931.9870.0540.215香叶基丙酮 Geranyl acetone39.5550.039--六氢呋喃丙酮 Hexahydrofarnesyl acetone53.6280.0060.0190.0122-己烷酮 2-Heptadecanone54.3421.2110.0480.062合计 Total5.195.6484.842呋喃类 Furan2-甲基呋喃 2-Methylfuran2.295-0.0040.0042-乙基呋喃 2-Ethylfuran3.416-0.1980.0922,4-二甲基呋喃 2,4-Dimethylfuran3.6430.13--2-丁基呋喃 2-Butylfuran9.3750.020.1840.2652-戊基呋喃 2-Pentylfuran14.4412.0713.2663.573合计 Total0.153.6523.934烷烃类Alkane辛烷 Octane5.7240.03--十三烷 Tridecane31.62--0.057十五烷 Pentadecane41.761-0.0160.029十六烷 Hexadecane46.469-0.016-(正)十七(碳)烷 Heptadecane50.8160.037--

续表2(Continued Tab.2)

类型Type化合物Compound保留时间tR(min)相对含量Relative content花瓣Petal唇瓣Labellun合蕊柱Gynandrium合计 Total0.0670.0320.086酯类 Ester乙酸甲酯 Methyl acetate1.8660.0150.0450.081壬内酯 Nonlacton35.455-0.055-棕榈酸甲酯 Methyl palmitate54.4560.1080.0070.009合计 Total0.1230.1070.09芳香族化合物Aromatic3,4-二甲氧基甲苯 3,4-Dimethoxytoluene28.753-0.0700.1573,5-二甲氧基甲苯 3,5-Dimethoxytoluene30.1360.5460.0750.114合计 Total0.5460.1450.271

注：“-”表示未检测到或不存在。

Note:“-” means that it is not detected or does not exist.

综上，西藏虎头兰鲜花全花的花香成分共89种，包括醛类、醇类、酮类、酯类、萜烯类、烷烃类、醚类、喃类、酚类及芳香族化合物十类。在一天中不同时间点花香成分都包括以上十个类别，但有一定差异，总数在减少，其中10∶00时花香种类88种、14∶00时87种、18∶00时83种；14点比10点少了一种反式-柠檬烯氧化物，18点出现了一种新物质(E)-2-壬烯醛；对于主要物质相对含量从10点到18点α-蒎烯，松萜相对含量先上升后下降，14点出现最高18.813%，而对甲酚呈现上升趋势，18点时最高15.932%，这些成分的相对含量均表现出明显的日变化，但萜烯类物质、醇类物质和酯类物质无论数量还是相对含量都占有很大比重，说明萜烯类物质、醇类物质和酯类物质是西藏虎头兰花香的主要成分。

西藏虎头兰各花器官花香组成成分不同，其中花瓣花香成分72种、唇瓣66种，合蕊柱62种，萜烯类物质、醇类物质和酯类物质在三个花器官中相对含量都占有很大比重。但含量有差异，花瓣中α-蒎烯，松萜占比30.242%最大，其次β-蒎烯12.502%、对甲酚9.53%、桧烯6.049%、DL-柠檬烯6.081%；唇瓣中对甲酚占比最大16.172%，α-蒎烯，松萜3.103%、α-松油烯15.160%、1-己醇4.975%和DL-柠檬烯11.613%；合蕊柱中对甲酚占比最26.804%，己醛5.264%、1-己醇15.747%、(E)-2-辛烯醛4.606%、α-蒎烯、松萜0.582%；相对含量最大的α-蒎烯、松萜从花瓣到合蕊柱逐渐降低，对甲酚呈上升趋势。结果说明花瓣为西藏虎头兰主要的释香花器官。

4 讨论与结论

花香是由各种挥发性成分共同作用形成的，各成分对花香的贡献可以通过其香气值(含量/嗅感阈值)衡量，具有较高香气值的成分可作为花的特征香气[16，17]。本研究利用快捷、简单、无溶剂的顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对西藏虎头兰鲜花的香气成分进行了分析鉴定。

西藏虎头兰鲜花全花的花香成分共89种，包括醛类、醇类、酮类、酯类、萜烯类、烷烃类、醚类、喃类、酚类及芳香族化合物十类。全花主要花香成分为α-蒎烯，松萜、对甲酚、DL-柠檬烯、β-蒎烯、桧烯、α-松油烯；α-蒎烯，松萜相对含量先上升后下降，14点出现最高18.813%，而对甲酚呈现上升趋势，18点时最高15.932%。

西藏虎头兰花器官的花香成分存在差异，且花瓣为主要的释香花器官。花瓣主要香气成分α-蒎烯，松萜、β-蒎烯、对甲酚、桧烯、DL-柠檬烯；唇瓣主要香气成分对甲酚、α-蒎烯，松萜、α-松油烯、1-己醇、DL-柠檬烯；合蕊柱主要香气成分对甲酚、己醛、1-己醇、(E)-2-辛烯醛，主要物质种类有明显差异，但花香成分无论是日变化或不同花器官中萜烯类物质、醇类物质和酯类物质无论数量还是相对含量都占有很大比重。在方永杰等对蕙兰普通花型进行香气成分检测，认为萜烯类化合物是蕙兰的主要香气成分[7]。魏丹等对浙江产蕙兰鲜花进行芳香成分分析，其主要香气成分依次是醇类、烷烃和萜烯类，主要香气物质为桉油精和(E)-己基葵烯炔等[13]。因此可以确定萜烯类物质、醇类物质和酯类物质为西藏虎头兰的主要花香成分。这些花香成分的协同作用形成了西藏虎头兰特有的香气，这特有的花香也是影响其独特的观赏价值因素之一。挥发性物质的留香时间与挥发物分子的大小和复杂度成正比[18]，西藏虎头兰的香气组分种类较多，分子较大并且结构复杂，各组分留香时间普遍较长且各不相同，这可能是其香气清新悠远的主要原因之一。

总之，西藏虎头兰花香的释放随一天中不同的时间点及不同的花器官，表现出规律性的变化，而这种变化最终受到的花香各成分生物合成的调控， 因此探索花香物质生物合成在一天中不同时间点的变化及在花器官上的变化，是揭示花香释放规律性变化的关键，而其花香物质的合成或停止合成如何受发育阶段和环境条件的协同调节仍需进一步研究探索。