刘振兴，高 翔，张 震，魏建昌*

（武安市中医院，河北 邯郸 056300）

结直肠癌是当今世界上发病率较高的恶性肿瘤之一，每年约有140万新增病例，平均每年约有60万患者由于结直肠癌死亡[1]，及时地诊断发现并进行有效的治疗能够帮助降低患者的死亡几率，但很大一部分患者在确诊时已经是癌症的进展期，局部的侵袭和远处的转移造成了患者的死亡。因此，预防和控制结直肠癌的进展、转移对改善患者的预后有重大的意义。本文通过分析HOTAIR的表达情况与结直肠癌病情的联系，寻找该基因对结直肠癌早期诊断的意义。

1 资料与方法

1.1 选取对象

选取本院2017年1月至2018年2月期间确诊患者的结直肠癌组织和癌旁正常组织标本，每组90例，同时密切记录患者的完整资料。

1.2 实验试剂与仪器

实验试剂为Takara公司的RNA逆转录试剂，美国伯乐公司的SYBR Gree实时定量试剂盒，生工生物（北京）有限公司设计合成的HOTAIR和GAPDH引物，实验仪器为瑞士罗氏公司的全自动电化学发光免疫分析仪。

1.2.1 RT-PCR法监测HOTAIR mRNA的表达

提取总RNA并定量，反转录为cDNA。linc RNA HOTAIR引物，上游5'CACTGGGGAACTCTGACTCC-3'，下游5'-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3'；GAPDH引物，上游5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3'，下游5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

PCR反应试剂：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNas-eH Plus），TaKaRa Code：DRR420A去1μL的2×PrimeSTAR Max Premix，0.4μL的sense primer，0.4μL的anti-sense primer，加灭菌蒸馏水至20μL，混合后离心。PCR反应体系，95摄氏度下孵育30秒，95摄氏度下孵育5秒，60摄氏度下孵育20秒，一共进行四十次循环反应；然后72摄氏度下孵育20秒，95摄氏度下孵育15秒后停止。使用荧光定量PCR方式处理试验数据，中位数以上的为高表达，中位数以下的为低表达。

1.2.2 随访

随访以电话回访或复查方式进行，回访时间为2019年6月20日。

1.3 统计学处理

使用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，数据用“均数±标准差”来表示，两组数据的比较使用t值进行检验，计数资料使用百分率进行表示，两组的比较使用x2进行验证，多组的比较需要使用方差进行分析，使用GraphPad Prism 6绘制统计图，用Kaplan-Meier法进行生存曲线的绘制，制作Cox回归模型分析影响结直肠癌患者的原因，当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 HOTAIR MRNA的表达

以HOTAIR与GAPDH的比值作为RT-PCR的定量分析，研究组中的表达水平为（0.86±0.05），对照组中的表达水平为（0.17±0.02），计算可知，P=0.03，差异具有统计学意义。

2.2 HOTAIR的表达与临床表现的关系

对比研究组与对照组，HOTAIR的表达与细胞浸润、肿瘤分期、淋巴结以及肝转移、脉管浸润等都有紧密关联，计算结果均为P＜0.05。该基因的表达程度越高，肿瘤分期越高、分化越低；在出现淋巴结转移、肝转移以及神经浸润症状的患者中，HOTAIR的表达程度明显高于未出现症状的患者；但该基因的表达与患者肿瘤的体积形态、病变类型和部位并没有明显联系。详见表1。

2.3 HOTAIR的表达水平与患者存活率的关系

根据回访结果进行分析，截止到回访日，一共有48位患者死亡，存活率为46.66%，死亡患者体内的HOTAIR表达水平为（0.885±0.100），生存患者体内的表达水平则为（0.660±0.115），P=0.002，差异具有统计学意义。该基因表达水平较高的患者共有58位，其中20位存活，38位死亡，生存时间的中位数为16个月，而在表达水平较低的32位患者中，10位死亡，22位生存，生存时间的中位数为21个月。使用Kaplan-Meier生存曲线进行Log-rank单变量的分析，结果显示，HOTAIR的表达水平影响着患者的生存时间，其结果x2=7.059，P=0.011，具有统计学意义，也就是说，HOTAIR表达水平越高的患者，生存时间越短，预后越差。详见表1。

2.4 Cox回归模型

HOTAIR表达水平（95%CI：1.306～2.913，P=0.001）、淋巴结转移（95%CI：1.039～1.622，P＜0.001）、分化程度（95%CI：1.719～2.369，P=0.035）等都是结直肠癌的预后影响因素。见表1。

表1 结直肠癌组织中lineRNA HOTAIR mRNA的表达及与临床相关病例参数的关系[n(%)]

3 讨 论

在之前有关于HOTAIR表达水平与疾病变化的临床研究中，美国斯坦福大学RINN[2]等学者研究证实，HOTAIR的表达主要是通过结合一系列的蛋白复合体进而调控下游的相应蛋白进行表达。CUPTA[3]等曾在研究中发现，HOTAIR在乳腺癌的病变部位以及转移部位组织细胞中表达水平是正常细胞中的200～2000倍，证实HOTAIR对乳腺癌的早期诊断以及病情监测有重要作用。KATATAMA等[4]则在研究中证实，HOTAIR对肾细胞癌的监测作用，LOEWEN等则在研究中证实HOTAIR的表达水平对肺癌的发展和预后有着密切联系。截至目前，国内少有相关文献指出该基因与结直肠癌病情的具体关系。

本研究从基因层面进行研究，证实HOTAIR在结直肠癌患者病变的细胞中的表达水平明显高于正常的肠黏膜细胞，并且，其表达水平与疾病的发展与变化密切相关，当HOTAIR的表达出现异常时，会打破人体内致癌与抑癌基因的平衡，导致肿瘤细胞的活性增加，加速肿瘤细胞在人体内的扩散和转移。

在后期的回访中，进一步证实，HOTAIR表达水平较高的患者，死亡率也相对增加，生存时间也明显低于表达水平较低的患者，因此，HOTAIR的表达水平可以作为临床应用中监测患者预后情况的重要指标。除此之外，Cox回归模型也能证明该基因的表达水平是直肠癌患者预后评测的一个独立因素。

综上所述，结直肠癌的病发和病变过程中伴随着HOTAIR的表达变化，深化研究基因表达与疾病机制以及临床治疗影响的联系，能够为当代结直肠癌病症的研究提供重要的参考价值，对于该方向的深入研究，将是以后值得重点关注的方向。