3侯 燕杜才富3

(1.贵州省农业科学院油菜研究所，贵阳 550008；2.农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北 武汉 430062；3.贵州禾睦福种子有限公司，贵阳 550008)

油菜菌核病是由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib) de Bary)引起的危害油菜生产的传统病害。油菜从苗期至成熟期都会受到菌核病危害，叶片、叶柄、茎秆、分枝、花、角果等都可能感染，导致油菜大面积减产[1]。菌核病还会导致油菜籽含油量的降低以及脂肪酸组成的变化，最终引起菜籽油品质的下降[2]。近年来，随着油菜生产种植密度的提高，菌核病危害日益加重，特别是雨水相对偏多的长江中下游地区影响最大[3]。因此，抗菌核病油菜资源的筛选与鉴定具有重要意义。

虽然目前尚未发现菌核病免疫的油菜种质资源，但材料抗性变异广泛存在，为抗病材料选育提供了理论基础[4]。本研究从田间收集菌核，并通过传代培养获得大量菌核。通过对大量甘蓝型油菜恢复系进行田间抗菌核病鉴定，筛选到39份抗菌核病材料，为抗病杂交油菜的创制提供了丰富的资源，为抗病机制的研究和抗菌核病基因的鉴定与分离奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病原分离与繁殖

2017年春季，从发病植株中收集菌核。将贵州长顺、贵阳油菜种植区田间收集到的菌核置于75%酒精消毒3～5 s，再用3%次氯酸钠消毒1～3 min，再用75%酒精清洗3～5 s，最后用无菌ddH2O漂洗3次，用已灭菌的吸水纸吸干病菌周围水分，置于PDA平板，在23 ℃培养[5]。培养7 d后，观察菌丝生长速度和菌落形态。菌核的繁殖使用胡萝卜培养基。

1.2 菌核病接种

油菜成株期抗病性鉴定采用自然接种和大田人工辅助控制接种。人工辅助控制接种选择往年发病较重的田块进行试验。2017年10月初直播。种植密度在4万株·(667 m2)-1左右。2017年12月，向病圃中丢放菌核，投掷密度为2～3粒·m-2菌核，保证菌核丰度和分布均匀性。前期采用常规管理，2018年3月中下旬，在鉴定区采用塑料布围拦保湿。蕾期至成熟期不进行任何病害防治措施。全部播种、浇水、病害调查等农事操作均在1 d内完成。病害调查前不在小区中走动，不破坏植株原有的分布结构。以中油821作为抗病对照。

1.3 抗性评价

以中油821为抗耐病对照品种划定抗病等级。病级调查与病级划分标准参考油菜品种菌核病抗性鉴定技术规程(NY/T 3068-2016)。将单株发病分枝的数量占总分枝数的比例定为分枝发病比例，将单株受害角果的数量占总角果数的比例定为角果受害比例。油菜单株病级划分如下：0级，全株茎、枝、果轴无症状；1级，全株分枝发病比例在1/3以下或主茎有小型病斑，全株角果受害比例在1/4以下；2级，全株分枝发病比例为1/3～2/3，或分枝发病比例在1/3以下，但主茎中上部有大型病斑，全株受害角果受害比例为1/4～2/4；3级，全株分枝发病比例达2/3以上，或分枝发病比例在2/3以下，但主茎中下部有大型病斑，全株角果受害比例为2/4～3/4；4级，全株绝大部分分枝发病，或主茎有多个病斑，或主茎中下部有大型绕茎病斑，全株角果受害比例超过3/4。发病率(P)公式如下：

病情指数(DI)公式如下：

根据病情指数计算相对抗性指数RRI：

其中，DI′表示抗病对照的病情指数，DI表示待评价材料的病情指数。

抗性评价：RRI≤-1.2为高抗，-1.22为高感。

1.4 种子的品质分析

将收获的种子在50 ℃烘箱中持续烘烤4 h后取出，放置至室温。按照说明书使用近红外分析仪测定种子的品质。统计分析和Pearson相关性的计算使用SPSS软件(V 13.0)进行。

2 结果与分析

2.1 病原收集与繁殖

从图1 A可以看出油菜菌核形态差异较大。进一步通过PDA培养基平板培养观察不同来源的菌核发现不同菌核产生菌丝的速度以及菌落形态也存在差异。核盘菌的不同菌株的菌丝间可产生拮抗反应，如果不同菌丝体的菌丝相互混合，没有任何拮抗反应，且菌丝间相互融合，表明它们之间遗传关系接近，若产生清楚的分界区域，说明两者不亲和，遗传关系较远[6]。用共培养实验分析不同来源的核盘菌，发现2种不同来源的菌核共培养后形成明显的分界线，将培养基分为2个部分，这表明2种菌存在明显的营养不亲和现象，遗传背景差异大(图1 B)。以上研究表明，收集的菌核存在较大的变异，可满足进行抗病材料筛选的需要。

图1 核盘菌、菌落的形态及抗菌核病材料发病率、病情指数和相对抗性指数之间的关系

图2 67份种质资源的品质性状

2.2 田间抗病性鉴定

2017年春季，在自然发病条件下，调查2 000份甘蓝型油菜恢复系成株期(收获前7 d)的菌核病发病情况，筛选到100份植株农艺性状优良且表现抗菌核病的恢复系材料。经过比较，去除种子品质不佳的材料，最终筛选出67份材料进行重复抗病性鉴定。2018年春季，将67份2017年表现为抗菌核的材料通过人工辅助控制接种进行重复的菌核病抗性鉴定。选择5份2017年表现为感病材料作为感病对照，并选择中油821为抗病对照。

分析2017年鉴定为感病的5份材料(感病对照)在2018年田间鉴定中的表现。从发病率上看，5份感病对照材料的发病率为19.2%～69.86%，均高于中油821(13.89%)，说明2018年田间人工辅助控制接种处理效果较好，菌核病发病率高，可以进行抗病选择。

分析2017年鉴定为抗病的67份恢复系材料在2018年田间鉴定中的表现，结果如下：从发病率上看，有39份材料发病率低于中油821，占待测材料的59.7%。从病情指数上看，病情指数低于对照的材料共有51份，占待测材料的76.12%。以相对抗性指数为标准划分抗性的结果显示，共51份材料表现为抗病，其中高抗材料10份，中抗材料15份，低抗材料26份。有22.39%的材料在2018年的鉴定中表现为感病，其中低感材料11份，中感材料3份，高感材料1份。

考虑到5份感病材料虽然其发病率均高于中油821，但仍然有1份材料表现为低抗。这表明在鉴定材料抗病性时，同时考虑发病率、病情指数和相对抗性指数，其鉴定结果可能更可靠。因此，进一步综合3个参数分析材料的抗性。结果显示，病情指数低于抗病对照的51份材料相对抗性指数均高于抗病对照。但其中只有39份抗性材料的发病率低于中油821(图1 C)。这39份抗性材料中，15份表现为低抗，15份表现为中抗，9份表现为高抗。

2.3 抗性材料的来源分析

从亲本来源上看，鉴定到的39份菌核病抗性材料来源丰富，支持材料抗性变异广泛存在的理论。具体分析材料来源显示，自交系D 02 RC和T 1441具有较好抗病性，但其单株抗性强弱也有差异。通过简单杂交或者复合杂交可以产生比单一亲本更好的抗性材料。如显R与57 R双杂交，中常与显R双杂交，LB 2822与中常双杂交，LB 2822、中常与显R三杂交，显R、57 R与D 02 RC三杂交组合可产生抗病性优良的后代。值得注意的是以LB 2822和中常为亲本进行正交和反交获得的后代中都可以产生抗病性较好的株系，表明控制该组合抗菌核病的遗传因子主要受细胞核控制。除了双杂交、三杂交，复合杂交也可以产生抗性较好的株系。相同来源的杂交材料，抗病性出现分化。例如同样来源于中常与LB 2822双杂交组合材料的抗性表现有高抗、中抗、抵抗、低感、甚至中感的差异，说明可以通过扩大选择群体筛选抗性优良的材料。

2.4 抗病性与种子品质的关系

不少报道显示油菜种子的品质与植株菌核病抗性有一定关系，进一步分析恢复系材料种子的品质与其抗病性有无相关性。首先用近红外分析仪在室温条件下分析67份油菜种子芥酸含量、硫甙含量、含油量、蛋白质含量以及油酸含量，结果如图2所示。然后计算品质性状与油菜菌核病发病率、病情指数以及相对抗性指数间的Pearson相关性。结果显示芥酸含量与相对抗性指数呈显著负相关，相关系数为-0.25(p<0.05)。其它品质性状与其病情评价参数均无明显相关性。

3 讨论与结论

3.1 高选择压、重复、大规模筛选是抗菌核病材料选育的有效途径

2017年从2 000份恢复系材料中筛选得到67份抗性材料用于后续鉴定，目前大部分材料易感菌核病，不利于品种生产与推广。因此，选育油菜品种不权要注重产量和品质，还应当重视对菌核病抗性的选择。

为选择出抗性更稳定的材料，进行了连续2年的田间鉴定。从病情指数和相对抗性指数看，有51份材料的病情指数和相对抗性指数低于抗病对照，占鉴定材料总数的73.91%。从发病率上看，有39份材料的发病率低于抗病对照，占鉴定材料总数的58.2%。但仍有26.08%～41.8%的材料在2017年自然发病条件下被鉴定为抗病，在2018年的高选择压下却被鉴定为感病。油菜菌核病抗性易受环境和病原多方面因素影响，如自然条件、种植密度的影响等，病原因素主要包括上一年田块菌核残留量、有活性菌核量等。因此在高发病风险的条件下进行选择，同时进行多年多点鉴定，加强选择才能选择出真正具有稳定抗性的种质。

此外，不论是自交系还是固定的杂交组合，其子代的抗病性都出现不同程度的分离。例如中常与LB 2822双杂交组合材料在田间表现出5种抗性级别，并且多数为低感菌核病。这些结果说明，扩大选择群体对选出农艺性状优良且抗性较好的材料至关重要。

3.2 多种抗病机制参与抗菌核病反应

目前关于油菜抗菌核病机制主要分为避病机制和生理抗性。避病机制主要包括改变株型和花期，从空间和时间上避开发病高峰时期[7-9]。油菜对核盘菌的生理抗性主要包括合成植保素、增加细胞木质化程度与表达降解核盘菌致病因子的相关基因等[1,10-15]。此外，油菜的品质也被报道可能与菌核病抗性有关。宋志荣等研究发现，高硫苷品系感染菌核病后，病情指数较低硫苷品系显著降低，受菌核病对影响较小[16]。有研究发现，受菌核病侵染的植株种子的千粒重、油酸含量下降，硫苷和芥酸含量升高[2]。袁德奎等[17]在1987—1992年6年间对甘蓝型油菜品质资源田间自然抗病性进行连续观察鉴定，结果发现种子芥酸、硫苷含量偏低的单株群体其菌核病发病偏重。本研究观察到，甘蓝型油菜种子芥酸与抗病性呈轻微负相关，与袁德奎等研究结果相符。以上研究表明，硫苷、芥酸等次生代谢物可能在油菜抵抗菌核病中起到一定作用。考虑到本研究采用连续2年选择的抗病育种群体，其硫苷，芥酸含量整体较低，油酸、油份以及蛋白含量整体偏高，变异较小，油菜品质与抗病性的关系有待进一步深入研究揭示。

4 展 望

本研究通过连续筛选，鉴定到一批抗菌核病的恢复系材料。鉴于油菜抗病性易受到环境影响，未来需要进一步扩大选择群体、增大选择压力，在不同区域进行抗性鉴定筛选工作来获得稳定可靠的抗菌核病育种材料。同时可以结合花期、株高、花瓣形态等生理特性，初步分析各种来源的抗性材料可能抗性机制。尽管分析初步显示芥酸和抗性呈正相关，但本研究获得的抗性油菜芥酸含量整体较低。因此在育种中，通过扩大选择群体，加大选择强度可以实现双低且抗性优良材料的选育。