刘 景，袁 媛

牙周炎(periodontitis)是口腔常见的慢性炎症性疾病，多由以革兰阴性厌氧菌(如内毒素脂多糖)为主的病原微生物引起，以牙周组织破坏为基本特征，是成人缺失牙的主要原因之一[1-2]。有研究表明[3]，病原微生物对牙周组织的直接破坏作用有限，而破坏牙周组织的主要原因是由病原微生物激发的宿主免疫反应，影响牙周防御细胞增殖、分化，而牙周防御细胞在抵抗病原微生物的同时释放可导致牙周组织破坏的炎症因子，最终导致牙周组织损伤。

柚皮苷(naringin，NRG)是一种双氢黄酮类化合物，是传统中药骨碎补、枳壳、枳实和化橘红等的主要药效成分，亦存在于葡萄柚、橘、橙等芸香科植物的果皮和果肉中。有研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血脂、抗动脉粥样硬化和调节血糖等多种生物活性和药理作用[4-6]，且可促进成骨细胞增殖分化、调节骨诱导生长因子，促进骨损伤部位的骨质生长，从而增强牙周组织的成骨能力[7-8]。为了明确柚皮苷对牙周再生治疗的作用机制，本研究从细胞水平研究柚皮苷对内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导下人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLF)增殖及白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-1β表达的影响，为临床应用柚皮苷防治牙周炎提供基础性理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

HPDLF细胞株(上海拜力生物科技有限公司)，柚皮苷(含量：98.28%，批号：MUST-16041912，成都曼思特生物科技有限公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，批号：10099133，上海栩冉生物科技有限公司),DMEM培养基 (批号：12800017，上海江林生物科技有限公司)，噻唑蓝(MTT，批号：146500700，美国Sigma 公司)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA试剂盒(美国R&D公司)，IL-6抗体、IL-8抗体、IL-1β抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，BCA蛋白测定试剂盒(美国Thermo公司)，ECL发光液和硝酸纤维素膜(美国Millipoer公司)。

1.2 主要仪器

Roche Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪(Roche公司)；SpectraMax iD5-多功能酶标仪(中国上海美谷分子仪器有限公司)；H1650台式高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与处理 HPDLF培养于含10%FBS、1×105U/L青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于95%空气+5% CO2、37℃的培养箱中培养。当HPDLF生长占培养瓶面积80%～90%时，常规传代培养，选择生长状态良好的3～6代细胞进行实验。

1.3.2 MTT法检测细胞存活率 将生长良好的HPDLF培养至密度为90%左右，进行细胞计数，以4×103个/孔细胞密度接种于96孔细胞培养板中，实验共分为5组，即空白对照(CON)组、脂多糖(LPS)组、脂多糖+柚皮苷高剂量(LPS+NRG 40 μg/mL)组、脂多糖+柚皮苷中剂量(LPS+NRG 20 μg/mL)组、脂多糖+柚皮苷低剂量(LPS+NRG 10 μg/mL)组。各组细胞置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后更换无血清培养液继续培养过夜后，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组分别加入相应剂量药物，LPS组、CON组加入等量的无血清DMEM低糖培养液；0.5 h后，除CON组外，其余各组均加入LPS(终浓度100 μg/mL)，CON组加入等量的无血清DMEM低糖培养液代替，继续培养24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃ 孵育4 h，小心吸弃培养液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min使形成的紫色甲瓒结晶完全溶解，用酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度值(A)，计算各组细胞存活率。细胞存活率=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期 将生长良好的HPDLF培养至密度为90%左右，进行细胞计数，以4×103个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，细胞培养、处理及分组同1.3.2项。除CON组外，其余各组细胞最后经LPS(终浓度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min离心10 min，收集细胞。70%冰乙醇固定细胞，4 ℃过夜。用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。

1.3.4 ELISA法检测HPDLF培养液中炎症因子的表达 将生长良好的HPDLF培养至密度为90%左右，进行细胞计数，以4×103个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，细胞培养、处理及分组同1.3.2项。除CON组外，其余各组细胞最后经LPS(终浓度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min离心10 min，取细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在490 nm处测样品吸光度值，计算细胞培养上清液中IL-6、IL-8和 IL-1β的含量。

1.3.5 Western blot法检测HPDLF中炎症因子蛋白的表达 将生长良好的HPDLF培养至密度为90%左右，进行细胞计数，以4×103个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，细胞培养、处理及分组同1.3.2项。除CON组外，其余各组细胞最后经LPS(终浓度100 μg/mL)刺激24 h后，收集细胞，以Western blot法检测HPDLF中炎症因子的表达。具体步骤：将收集的细胞用预冷PBS冲洗3次，加入RIPA裂解液提取细胞蛋白后，BCA法进行蛋白定量，加5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(电压60 V至指示剂进入分离胶，继以120 V电泳至结束)，蛋白分离后采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上(4℃，电压100 V，1 h)，5%脱脂奶粉4 ℃条件下封闭1 h，IL-6、IL-8、IL-1β和GAPDH一抗(1∶1 000)稀释液室温孵育过夜，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶标记的二抗(1∶10 000)稀释液室温孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，将ECL试剂盒说中发光液均匀地滴在PVDF膜上，反应1 min，再将PVDF膜放入暗室压片成像。结果用目的蛋白的灰度值与内参(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J软件分析成像结果，进行IL-6、IL-8和IL-1β蛋白定量。

1.3.6 Real-time PCR法检测HPDLF中炎症因子的表达 将生长良好的HPDLF培养至密度为90%左右，进行细胞计数，以4×103个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中，细胞培养、处理及分组同1.3.2项。除CON组外，其余各组细胞最后经LPS(终浓度100 μg/mL)刺激24 h后，收集细胞，Trizol法提取总RNA，去除DNA污染后，使用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒处理，合成cDNA，按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明方法进行实时定量。PCR反应条件为：95 ℃(30 s)预变性后，95 ℃(5 s)→60 ℃(30 s)，40个循环；PCR引物序列为IL-6：Sense：5′-CAAATTCGGTACATCCTCG-3′，Antisense：5′-GCCTCTTTGCTGCTTTCA-3′；IL-8：Sense：5′-ACTCCAAACCTTTCCACC-3，Antisense：5′-CTTCTCCACAACCCTCTG-3′；IL-1β：Sense：5′-TGATGGCTTATTACAGTGGC-3′，Antisense：5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3′；GAPDH：Sense：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′；Antisense：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用2-ΔΔCt方法分析相关mRNA的表达量[9]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 柚皮苷对脂多糖诱导的牙周膜成纤维细胞增殖的影响

与CON组比较，LPS组细胞存活率显著降低(P<0.05)；40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS诱导的HPDLF损伤，与LPS组比较，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+ NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组细胞存活率均显著提升(P<0.05)(图1)。

与CON组比较，*：P<0.05；与LPS组比较，#：P<0.05

图1柚皮苷对脂多糖诱导的牙周膜成纤维细胞增殖的影响

Fig.1Effect of naringin on proliferation of periodontalligament fibroblasts induced by lipopolysaccharide

2.2 柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF细胞周期的影响

与CON组比较，LPS组HPDLF细胞周期进程减慢，S期、G2/M期细胞百分率显著降低，但G0/G1期细胞百分率明显增加；与LPS组比较，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组HPDLF细胞周期进程减慢，S期和G2/M期细胞百分率均显著增加，G0/G1期细胞百分率显著降低，见图2。

与CON组比较，*：P<0.05；与LPS组比较，#：P<0.05

图2柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF细胞周期的影响

Fig.2Effect of naringin on lipopolysaccharide-inducedcell cycle of HPDLF

2.3 柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF培养液中炎症因子水平的影响

ELISA方法检测结果显示，与CON组比较，LPS组HPDLF培养液中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子含量显著升高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子含量显著降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF培养液中炎症因子水平的影响

组别剂量/(μg/mL)IL-6/(pg/mL)IL-8/(pg/mL)IL-1β/(pg/mL)CON组—21.06±2.2424.08±2.4930.26±3.16LPS组—66.23±6.64∗#70.25±7.06∗#88.21±9.02∗#LPS+NRG组4032.05±5.56∗33.05±3.82∗36.05±3.81∗2030.25±3.05∗32.21±3.41∗34.08±3.52∗1029.21±3.21∗32.03±3.32∗33.51±3.41∗

与CON组比较，*：P<0.05；与LPS组比较，#：P<0.05

2.4 柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF中炎症因子蛋白表达的影响

Western blot方法检测结果显示，与CON组比较，LPS组HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子蛋白表达显著升高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子蛋白表达水平显著降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.5 柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF中炎症因子基因表达的影响

Real-time PCR方法检测结果显示，与CON组比较，LPS组HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子mRNA表达显著升高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+NRG 40 μg/mL组、LPS+NRG 20 μg/mL组、LPS+NRG 10 μg/mL组HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子mRNA表达水平显著降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

与CON组比较，*：P<0.05；与LPS组比较，#：P<0.05

图3柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF中炎症因子蛋白表达的影响

Fig.3Effect of naringin on the expression of inflammatoryfactors in lipopolysaccharide-induced HPDLF

与CON组比较，*：P<0.05；与LPS组比较，#：P<0.05

图4柚皮苷对脂多糖诱导的HPDLF中炎症因子基因表达的影响

Fig.4Effect of naringin on expression of inflammatory factor gene in lipopolysaccharide-induced HPDLF

3 讨 论

HPDLF是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，作为牙周组织的主要细胞之一，其具有牙周组织再生能力，可分化形成牙骨质、牙周膜、牙槽骨[10-11]。在牙周组织再生过程中，如存在牙周炎症微环境，可影响牙周炎患者HPDLF促进组织再生的过程[12]。因此，抑制炎症因子的产生，可有效阻断牙周炎症对牙周组织的过度破坏。

LPS是革兰阴性厌氧菌外膜主要成分，被公认为牙周病致病因子。有研究表明[13-15]，LPS可通过破坏牙龈结合上皮进入牙周组织，与HPDLF的磷脂相互结合，发挥细胞毒作用，破坏细胞膜结构，影响HPDLF生长、合成代谢，使细胞溶酶体酶大量释放，激活缓激肽系统，并刺激巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞等分泌IL-6、TNF-α等多种炎症细胞因子，而龈沟液中的炎症细胞因子，可介导局部炎症反应，从而参与牙周炎的发生和发展过程。Liu等[16]研究结果显示，LPS可通过TLR4调节NF-κB信号通路及其与CD14的相互作用，激活宿主细胞HPDLF表达多种前炎症细胞因子，从而始动牙周组织的破坏过程。基于上述研究成果，炎症微环境是牙周炎患者牙周组织的主要微环境，亦是影响牙周组织再生的关键因素，如在药物作用下克服牙周组织局部的炎症环境，可有效促进牙周组织再生。本研究结果显示，经LPS刺激后的HPDLF存活率显著降低，细胞周期进程减慢，S期、G2/M期细胞百分率显著降低，但G0/G1期细胞百分率明显增加；而40 μg/mL、 20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS诱导的HPDLF损伤，细胞存活率均显著提升，细胞周期进程减慢，S期和G2/M期细胞百分率均显著增加，G0/G1期细胞百分率显著降低。

IL-1β、IL-8等炎症细胞因子是来源于单核-巨噬细胞的多功能生物活性物质，因单核细胞是机体抵御病原生物感染的主要效应细胞，因此，IL-1β、IL-8等细胞因子水平高低决定单核细胞参与抗感染和炎症反应的能力[17-18]。有研究表明[19]，炎症损伤级联反应中，炎症组织细胞将释放过量的IL-6、IL-8、IL-1β等炎症细胞因子入血，成为神经毒性因子，彼此之间相互作用，形成恶性循环，从而使组织损伤加重。其中，IL-1β属于IL-1家族成员之一，是由单核-巨噬细胞分泌的细胞调节因子，由于其本身就是内源性的致热源，可以自我激活表达，促使一些炎症因子的活化及异常表达，从而刺激血管内皮细胞，使更多的粘附分子表达，启动多种细胞因子产生级联反应，致使白细胞聚集、浸润，与牙周组织破坏密切相关。IL-8由单核-巨噬细胞分泌，中性粒细胞、多形核白细胞等多种细胞产生，其主要功能是趋化并活化嗜中性粒细胞、单核细胞等，参与炎症反应和免疫应答过程。IL-8的异常分泌会造成局部组织的炎症反应，在低氧、缺血等条件下可引导合成和释放具有白细胞趋化活性的多源性细胞因子，引导中性粒细胞进入龈沟液，在中性粒细胞的选择性补充和激活过程中有重要作用。IL-6属促炎症细胞因子，是由活化的成纤维细胞和T淋巴细胞产生的淋巴细胞因子，在正常健康的生理状态下，IL-6生理性存在于龈沟内，在血液及组织中的含量比较低，但是在炎症反应过程中大量表达使其浓度升高，可协同集落刺激因子，促进原始骨髓细胞分化和增殖。所以 IL-6的含量可以作为炎症反应程度的指标，IL-6在血液及组织细胞中的水平越高则表示炎症反应程度越重，一定程度上反应了牙周炎的严重程度[13]。另有研究表明，IL-6可以诱导免疫反应过程中的T淋巴细胞和巨噬细胞分泌，在成骨细胞的形成过程中IL-6大量表达[20]。本研究结果表明，经LPS刺激后的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表达显著升高，而经不同浓度(40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL)的柚皮苷预处理后，HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表达水平显著降低，提示柚皮苷可通过调节HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β分泌及其相互级联作用，降低牙周组织炎症反应，拮抗LPS作用。

本研究结果表明，NRG对LPS诱导的HPDLF损伤具有保护作用，并可通过抑制LPS诱导的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白及基因表达水平，促进HPDLF增殖，即柚皮苷可通过拮抗LPS对HPDLF增殖的抑制作用，减弱LPS对HPDLF及牙周组织破坏程度。以上研究结果为开发以柚皮苷为药效成分治疗牙周病提供了基础理论依据。但上述作用机制可能仅仅是一方面，有关柚皮苷对LPS诱导的HPDLF增殖作用的具体机制，尚需进一步研究探讨。