广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510663）

内容提要： 目的：探讨不同浸提介质对一次性使用血液灌流器细胞毒性的影响。方法：采用能快速准确地评价细胞存活率和细胞毒性的定量分析方法-MTT法，分别检测不同血液灌流器在含血清培养基、非含血清培养基和0.9%氯化钠注射液三种浸提介质的浸提液对小鼠成纤维细胞相对存活率的影响。结果：检测结果表明，不同的浸提介质，细胞毒性结果差异明显。氯化钠注射液浸提的样品存活率最高，非含血清培养基次之，含血清培养基浸提的样品存活率最低。结论：在检测中，要根据产品的使用方法和用途选择适宜的浸提介质，尽量模拟临床使用进行选择。

血液灌流是指将患者血液引入装有固态吸附剂的灌流器当中，通过吸附作用来清除内源性或外源性毒素，并将净化了的血液回输到体内的一种血液净化的方法[1,2]。血液灌流器在医疗器械领域主要应用于急性药物和毒物中毒、尿毒症毒素的清除、降脂的新疗法、提高移植肾的存活率及治疗皮肤病等[2]。该方法中起关键作用的就是内部的吸附材料，目前研发出的吸附材料主要有多功能碳材料（包括活性炭材料和碳纳米管）、树脂吸附材料（离子交换树脂和吸附树脂）、多糖类和免疫吸附剂等高分子材料。吸附材料是该技术的核心部分，应对人体安全无毒，无过敏反应，不引起热原，有稳定的化学性质，不破碎，不易脱落并有良好的血液相容性等使用要求[3]。所以，一次性使用血液灌流器的应用发展取决于吸附材料的发展应用。目前，临床中常见的吸附材料为活性炭材料和树脂材料。但由于目前市面上一次性使用血液灌流器的种类比较少，关于它的疗效也缺乏准确的数据，为了明确其清除疗效，为临床应用提供依据，应该进一步研究其效果[4]。

为了确保灌流器在临床中清除人体内源性和外源性药物、毒物及代谢产物的安全性和有效性，国家食品药品监督管理局在2002年6月首次发布了YY0464-2003《一次性使用血液灌流器》[5]，2009年进行了第一次修订，并于2010年12月1日实施YY0464-2009《一次性使用血液灌流器》[6]，该标准提出灌流器产品进行注册时应按GB/T 16886.1-2001的规定内容进行生学学性能评价，其中细胞毒性试验应按照GB/T 16886.5的规定进行，且细胞毒性计分应不超过1分。GB/T 16886.5-2017[7]中提出了3种检测方法：浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验（分为琼脂扩散试验和滤膜扩散试验），并且附录C中介绍了MTT细胞毒性试验的方法。本试验选取了2种树脂类灌流器和4种活性炭类灌流器，在用生理盐水清洗后取吸附剂，然后用3中不同浸提介质浸提后采取MTT法进行体外细胞毒性评价，来探讨不同浸提介质对一次性使用血液灌流器细胞毒性的影响。

1.材料与方法

1.1 试验样品

本次进行细胞毒性研究的灌流器有6个，名称为一次性使用血液灌流器，样品序号分别为1～6，其中活性炭成分的有4个，树脂成分的有2个。

1.2 样品的制备

采用GB/T16886.5-2017附录C中推荐的MTT法进行试验：①浸提介质：0.9%氯化钠注射液，MEM培养液，含血清的MEM培养液；②浸提比例：每0.2g的样品加入浸提介质1mL（其中生理盐水浸提的采用0.4g的样品加入浸提介质1mL）；③浸提时间：37°C放置24h。

1.3 试验细胞

选取L929小鼠成纤维细胞株（中国科学院上海细胞所）。

1.4 试验材料

试验试剂：MEM培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），异丙醇（广州化学试剂），氯化钠（东莞市普济药业有限公司），MTT（阿拉丁）。

试验仪器：二氧化碳培养箱（Thermo），生物安全柜（新华医疗），酶标仪（美国Thermo Labsystem）。

1.5 试验方法

制样前的准备：将样品采用3500mL不含肝素的生理盐水进行预充，然后放干生理盐水取吸附剂备用。

样品浸提液的制备：分别用三种浸提介质浸提6个样品，于37°C放置24h，制备样品浸提液。

阴性和阳性对照：高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品，聚氯乙烯浸提液作为阳性对照。

空白对照：本实验设置2个空白对照组，空白1是采用含血清的培养基，空白2是用于采用0.9%氯化钠浸提液作为浸提介质，在使用前用MEM（1×）含血清培养基等体积混合后使用的样品组的空白。

试验步骤：将培养至近汇合的细胞消化后接种于96孔板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设至少6个孔，每孔接种100μL细胞悬液。置CO2培养箱37°C培养24h。

弃去96孔内原培养液。空白对照组1加入新鲜细胞培养液100μL，空白对照组2加入0.9%氯化钠浸提液50μL和50μL的MEM（1×）含血清培养基；阴性和阳性对照液各100μL，供试品组加入试验样品液100μL，置CO2培养箱37°C继续培养24h。

表1. 灌流器及对照组的吸光度值

然后置显微镜下观察细胞形态。去除平板内细胞培养基，每孔加入50μL质量浓度为1mg/mL的MTT溶液，继续培养2h后弃去孔内液体，加入100μL异丙醇，置振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm波长下测定吸光度（参照波长650nm）。并计算相对存活率（RGR）：RGR=试验组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。

2.结果

表1为各个一次性使用血液灌流器在三种不同浸提介质条件下，对L929细胞存活率的影响。由下表可以看出在浸提介质为0.9%氯化钠浸提时，相对存活率比较高，培养基次之，含血清培养基浸提时相对存活率较小。

3.讨论

目前，一次性使用血液灌流器产品广泛应用于医疗领域，此类产品属于三类医疗器械产品，在进入临床试验前，需要先进行生物学评价。本文旨在不同的浸提介质对灌流器细胞存活率的研究。对于浸提介质的选择，国内外的标准中推荐了含血清培养基、生理盐水和其他适宜的介质[7,8]。此外，对于浸提如离子化合物这类极性物质宜考虑采用无血清的培养基。本实验设计了这3种不同的浸提介质制备浸提液的方法，并通过MTT法测细胞存活率，来寻找适合灌流器类产品的浸提方法。

血清中含有多种细胞生长因子，不同的细胞会选择不同种类的血清，来满足细胞生长所必须。此外，含血清培养基具有浸提极性和非极性两种物质的能力并近似的模拟体内环境，能够更好地反映医疗器械的生物安全风险[9]。所以，对于很多种类的医疗器械产品采用含血清的培养基进行浸提即可达到实验所需。但对于一些含有吸附作用的产品如含活性炭和树脂的血液灌流器，他们在用含血清培养基浸提时，能够吸附血清蛋白等其他一些未知的营养成分。所以对于一些有吸附作用的医疗器械产品，应该考虑下如果用含血清培养基作为浸提介质，是否会降低细胞生长的一些营养物质，造成细胞状态不好，导致细胞毒性增加。而产生一种假阳性的结果。本文实验采用了3种不同的浸提介质制备浸提液，3类不同介质对于同一个样品，产生的细胞存活率差异明显，这个结果也验证了这个说法。

本研究对比了3类不同浸提介质的选择对于灌流器类产品的体外细胞毒性的影响，并分析了原因。在实验过程中，应该根据产品的属性选择合适的介质进行浸提，不能一贯的按照标准的方法采用含血清的培养基。而是应该结合试验的目的及产品的特性选择适宜的浸提介质。