黄珊珊 赵静雅 陈洁 杨扬

HBV会干扰宿主肝细胞的先天免疫反应和适应性免疫反应，进而导致持续感染以及肝损伤和炎症[1-2]。通常慢性HBV感染的患者体内由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的病毒特异性T细胞杀伤反应较差甚至不存在，出现这种情况是由于T细胞在免疫应答反应中的‘疲劳’现象所致[3-4]。T细胞‘疲劳’的主要表征为增殖能力缺乏、效应细胞毒活性差、细胞因子产生受损、细胞凋亡增加以及多种抑制性受体持续表达[5-6]。但是阻断抑制性受体途径对于增加CTL数量及有效性的作用效果并不明显[7]，因此需探究导致T细胞功能障碍的其他因素，为HBV感染患者提供有效的组合治疗靶点。前列腺素类存在于几乎所有的哺乳类细胞中，并且对多种刺激(如感染或者创伤)有反应，可作为脂质激素样信号分子参与多种疾病的生理病理过程[8-9]。本研究以临床样本及实验动物为研究对象，探究前列腺素类中的PGE2对HBV感染后病毒复制及CD8+T淋巴细胞功能的影响。

材料与方法

一、临床血样采集及检测

选取西安大兴医院2018年1月至2018年12月慢性乙型肝炎(CHB)但未治疗的患者120例和健康体检者60名，收集血液样本。CHB患者的诊断符合第七届全国病毒性肝炎学术会议中制定的诊断标准，排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒和艾滋病病毒(或患有自身免疫性肝病)感染的患者。

血清中HBV DNA、ALT和AST检测采用瑞士罗氏公司提供的试剂盒。

采用人前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒(上海EK-Bioscience公司)检测血清中PGE2的浓度。采用ELISA试剂盒(瑞士Roche公司)检测小鼠血清中HBsAg的浓度。

二、 动物实验及分组

24只6～8周龄的C57BL/6小鼠购自西安交通大学[许可证号：SYXK(陕)2015-002]，体质量(28±2)g。重组病毒rAAV8-1.3HBV购自北京五加和分子医学研究所有限公司，参照王刚等[10]建立的HBV感染小鼠模型。采用戊巴比妥钠将小鼠麻醉后，所有小鼠尾静脉注射4×1010g/只rAAV8-1.3HBV，注射持续5～8 s。

然后将rAAV8-1.3HBV注射后的小鼠分为3组，对照组、PGE2组和PGE2受体拮抗组，每组各8只。PGE2组小鼠每2天注射1次PGE2的稳定类似物16,16-dimethyl PGE2(1 mg/kg，购自美国Sigma公司)，PGE2受体拮抗组小鼠每2天注射1次PGE2受体(EP2和EP4)拮抗剂AH6809和GW627368X(1 mg/kg，购自美国Cayman公司)，对照组注射DMSO，持续2周。

三、检测方法

(一)流式细胞仪检测CD8+T细胞功能相关指标 以密度梯度离心法从CHB患者的血样及各组小鼠的肝脏组织中分离单核细胞。用流式细胞仪双标记免疫荧光法测定患者血样CD8+T淋巴细胞的占比，CD8+T淋巴细胞Tim3、颗粒酶B和穿孔素的表达，以及小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞的占比，CD8+T淋巴细胞Tim3、TNF-α和IFNγ的表达。所有荧光标记单克隆抗体均购自美国Abcam公司。仪器采用美国BD Biosciences公司的BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪，BD FACS Diva 7.0软件进行数据的统计分析。

(二)实时定量PCR检测血清pgRNA的表达 采用Trizol试剂从各组小鼠血清中分离总RNA，采用实时定量PCR法分析各组小鼠血清中pgRNA的表达。采用SYBR Green Master试剂盒检测pgRNA mRNA的表达。pgRNA的引物为：上游引物5′-CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT-3′，下游引物5′-AGGATAGAACCTAGCAGGCATAAT-3′。每个样本重复3次，β-actin为内参。

三、统计学分析

结 果

一、CHB患者血清中PGE2与病毒复制和肝损伤的关系

CHB患者血清中PGE2水平(877.20±43.27)显著高于健康体检者(201.30±13.38)(t=14.92，P<0.05)。PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST水平显著高于PGE2低水平患者，差异有统计学意义。见表1。

表1 各组患者血清HBV DNA、ALT和AST水平对比(±s)

二、CHB患者血清中PGE2与CD8+T淋巴细胞功能的关系

与PGE2低水平患者相比，PGE2高水平患者血样CD8+T细胞Tim3的表达显著增加(P<0.05)，颗粒酶B的表达显著降低(P<0.05)。穿孔素的表达及CD8+T细胞的占比在两组患者间差异无统计学意义。见表2。

表2 各组患者血样中CD8+T淋巴细胞功能对比(%,±s)

三、PGE2促进HBV复制

与对照组相比，PGE2组小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平显著增加(P<0.05)，PGE2受体拮抗组小鼠血清中HBV DNA及pgRNA水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平对比(±s)

注：与对照组相比，*P<0.05

四、CD8+T淋巴细胞参与PGE2对HBV复制的调控

与对照组相比，PGE2组小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞Tim3的表达显著增加(P<0.05)，TNF-α和IFNγ的表达显著降低(P<0.05)。PGE2受体拮抗组小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞中Tim3的表达显著降低(P<0.05)，TNF-α的表达显著增加(P<0.05)，IFNγ的表达无显著变化。3组小鼠肝脏中CD8+T淋巴细胞的占比差异无统计学意义。见表4。

表4 各组小鼠肝脏中CD8+T淋巴细胞功能对比(%, ±s)

注：与对照组相比，*P<0.05

讨 论

研究报道，具有致病表型的Th17细胞可介导PGE2促进HBV诱导的免疫损伤[11-12]。本研究结果显示，PGE2在CHB患者血清中的水平显著高于健康体检者，且PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST的含量显著高于PGE2低水平患者，这些结果提示CHB患者肝损伤可能与PGE2水平的增加有关，且由于血清HBV DNA含量的增加，推测PGE2促进HBV复制可能是其诱导肝损伤的机制之一。但是PGE2参与多种细胞活动的调节过程，此推断是否成立还需要进一步验证。

研究报道，抑制性受体的持续表达与T细胞免疫衰竭有关[13]。本研究显示，PGE2高水平患者血清中CD8+T细胞Tim3的表达显著增加，提示PGE2可能是通过调控抑制性受体Tim3的表达来促进T细胞衰竭。对慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染和HIV感染的研究中发现，PGE2对CTL细胞的存活及有效性具有抑制作用[14-15]。CTL细胞释放的穿孔素和颗粒酶可杀伤靶细胞(病毒、肿瘤细胞等抗原物质)，对肿瘤及感染类疾病的治疗具有积极的作用。本研究发现，PGE2高水平患者血清中颗粒酶B的表达显著低于PGE2低水平患者，穿孔素的表达也有降低的趋势但差异无统计学意义，由此推断PGE2可降低CTL细胞释放的穿孔素和颗粒酶，进而抑制CTL细胞对病毒的杀伤性。

PGE2通过与其受体(EP1、EP2、EP3和EP4)结合调控炎症、免疫反应、血压等多种病理过程[16-17]。为探讨PGE2及其受体在HBV感染后病毒复制及CD8+T细胞免疫调控中的作用，本研究将PGE2稳定类似物或者PGE2受体(EP2和EP4)拮抗剂注射入rAAV8-1.3HBV质粒感染小鼠体内，结果发现PGE2类似物可增加HBV感染小鼠血清中HBV DNA的水平，而PGE2受体拮抗剂显著降低HBV DNA水平，这些结果进一步证实PGE2可通过与其受体EP2和EP4结合，进而促进HBV的感染及复制过程。

血清中pgRNA的含量可反映肝脏中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的活性，HBV cccDNA可形成微染色体稳定存在于细胞核中，其难以清除是HBV感染慢性化和停药后复发的重要原因[18]。因此检测血清中pgRNA水平对于评价HBV感染进程及复发具有重要的指导意义。本研究中，PGE2类似物显著增加HBV感染小鼠血清中pgRNA的水平，PGE2受体拮抗剂显著降低pgRNA的水平。提示PGE2在评价HBV感染进程及复发中具有重要意义，且PGE2受体阻断能显著缩短HBV感染进程，降低复发。

虽然PGE2及其受体拮抗剂对CD8+T细胞的数量无影响，但PGE2可能影响CD8+T细胞的功能。检测CD8+T细胞抑制性受体(Tim3)及细胞因子(TNF-α和IFNγ)的表达结果证实，PGE2类似物显著增加CD8+T细胞Tim3的表达，降低TNF-α和IFNγ的表达。PGE2受体拮抗剂有相反的作用。TNF-α可抑制肿瘤发生和病毒复制[19]，IFNγ是免疫干扰素，在抗病毒的先天免疫反应及适应性免疫反应中发挥重要作用[20]。因此这些结果进一步证实PGE2促进HBV的复制，且损伤CD8+T细胞的免疫清除。PGE2受体拮抗剂可缓解T细胞的免疫衰竭。本研究也有不足之处，样本量太少、缺乏细胞水平的研究及对机制的深入探讨，将会在后续研究中进行深入分析。

总之，PGE2在CHB患者血清中呈高表达，PGE2促进HBV复制及T细胞衰竭，PGE2信号阻断不仅可修复T细胞功能还可控制HBV复制。因此PGE2阻断将可能成为CHB患者治疗的新策略。