李 燕 潘炎帆 张 涛 韩忠耀

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

千里光为菊科植物千里光(SenecioscandensBuch.-Ham)的干燥地上部分[1-2]，具有清热解毒、明目退翳、杀虫止痒、散瘀消肿等功效[3-4]，以及抗菌抗病毒、抗癌、消炎利胆等药理作用，被广泛应用于各种急性炎症的治疗[5]。其主要活性成分以总黄酮、总生物碱、金丝桃苷、绿原酸为代表。研究[6-7]表明，黔产千里光活性成分含量以8月份地上部分含量最高。目前，关于千里光的研究多以成分、药理作用及含量测定为主，有关千里光生品指纹图谱相关报道较少[8]，而关于千里光炮制后的指纹图谱以及含量变化规律尚未见报道。

试验拟以黔产千里光为研究对象，分析其炮制前后HPLC指纹图谱，同时测定炮制前后的总黄酮、总生物碱、金丝桃苷、绿原酸含量变化规律，旨在揭示炮制对该药的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

千里光：自采药材(表1)，采集时间为2018年8月，采集药材均经黔南民族医学高等专科学校王传明副教授鉴定为菊科植物千里光(S.scandensBuch.Ham)全草，样本保存于黔南民族医学高等专科学校中药标本馆；

芦丁对照品(批号CHB170303，纯度≥98%)、苦参碱对照品(批号CHB160907，纯度≥98%)、绿原酸对照品(批号CHB170713，纯度≥98%)、金丝桃苷对照品(批号CHB160904，纯度≥98%)：成都克洛玛生物科技有限公司；

表1 千里光药材采集信息表

乙腈：色谱纯，重庆川东化工有限公司；

纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；

其余试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Agilent1260型，美国安捷伦科技有限公司；

紫外—可见分光光度计：Cary 100型，美国安捷伦科技有限公司；

数显恒温水浴锅：SG-4050C型，上海硕光电子科技有限公司；

离心机：2.0R型，德国Heraeus公司；

电子天平：DV215CD型，奥豪斯仪器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备 根据文献[6-7]并略作修改。精密称取芦丁对照品和苦参碱对照品，分别置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.352 0，0.262 0 mg/mL的芦丁对照品溶液和苦参碱对照品溶液；精密称取绿原酸对照品和金丝桃苷对照品，置于同一50 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，其中绿原酸、金丝桃苷浓度分别为0.164 0，0.084 0 mg/mL。

1.2.2 炮制品及供试品溶液的制备 取地上部分于55 ℃下烘干备用，得千里光生品。取烘干后的千里光，每100 g药材加入25 g米醋，闷润2 h，文火炒至药材颜色加深，取出放凉备用，得醋炙千里光。取烘干后的千里光生品、醋炙品粉末(过65目筛)约1.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇100 mL，称定质量，回流提取1.0 h，静置放冷再称量，70%乙醇补足质量，摇匀，过滤，滤液于0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 根据文献[8]并略作修改。色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.1%磷酸水(A)—乙腈(B)，梯度洗脱：0～5 min，2% B；6～10 min，2%～7%B；11～35 min，7.0%～16% B；36～50 min，17%～25% B；51～65 min，25%～100% B。流速1.0 mL/min，样品进样量20 μL，对照品进样量5 μL，柱温35 ℃，检测波长327 nm，检测时间65 min。

1.2.4 方法学考察

(1) 线性关系考察：参照文献[6-7]。

(2) 精密度、稳定性及重复性试验：参照文献[9-10]。

(3) 加样回收率试验：取已知含量的同一样品提取液6份，分别精密加入绿原酸、金丝桃苷标准品溶液适量进行试验。

1.2.5 聚类分析 参照文献[11-12]的方法，将10批千里光生品(S1～S10)和醋炙品(G1～G10)作为研究对象，采用聚类分析法，观察不同批次药材之间的差异性。

1.3 数据处理

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会2004A版)，对指纹图谱进行相似度评价。聚类分析利用SPSS 18.0软件，采用组间连接法，选用平方Euclidean距离作为刻度，分别进行聚类。采用Excel软件对试验结果进行处理。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

芦丁和苦参碱的检测波长参照文献[6-7]，分别选择509，208 nm。采用二极管阵列检测器对千里光供试品溶液进行扫描，发现327 nm下的出峰数目最多，基线相对稳定，且分离峰之间的分离效果也较好，同时绿原酸和金丝桃苷在327 nm下吸收信号较强，达到了有效分离，故最终确定检测波长为327 nm。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 以浓度为横坐标，以吸光度或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.2.2 其他 由表3可知，36 h内仪器的精密度、方法的重复性及供试品稳定性均在3%以内，表明仪器精密度、方法的重复性及供试品36 h内的稳定性良好。

表3方法学考察试验结果

Table3Theresultsofmethodologicalexperimental (n=6) %

名称精密度RSD重复性RSD稳定性RSD芦丁0.981.431.44 苦参碱0.691.261.36绿原酸 相对保留时间0.310.340.29相对峰面积1.521.691.57金丝桃苷相对保留时间0.350.410.47相对峰面积1.621.391.62

2.2.3 加样回收率试验 结果表明，绿原酸、金丝桃苷的平均加样回收率分别为101.57%，99.68%，且RSD<2.08%，表明所建立的方法回收率良好。

2.3 指标性成分及参照峰的选择

绿原酸、金丝桃苷、总黄酮、总生物碱为千里光的主要活性物质，故将其作为指标性成分。由图1可知，绿原酸是千里光含量较高的活性成分，指纹图谱中其峰面积较大，且保留时间为22.41 min，保留时间适中，故确定3号峰(绿原酸)为指纹图谱的参照峰。

图1 混合标准溶液HPLC图

Figure 1 The HPLC chromatograms of the mixed reference substance

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 指纹图谱的建立 由图2～5可知，3(S)号峰为绿原酸吸收峰，9号峰为金丝桃苷吸收峰；10批千里光生品与醋炙品指纹图谱分别确立12，8个共有峰，其中，生品共有峰为1～12号峰(见图4)，醋炙品共有峰为1，2，3，4，7，8，9，12号峰(见图5)，表明醋炙显著降低或改变了药材成分。

由表4～7可知，生品共有峰的相对保留时间RSD<0.31，醋炙品共有峰的相对保留时间RSD<0.44，说明仪器分析条件稳定、可行，但二者共有峰的相对峰面积RSD较大，表明不同批次的生品和醋炙品成分含量均差异较大。

图2 千里光生品HPLC指纹图谱

Figure 2 HPLC fingerprints of rawS.scandensBuch.Ham

图3 千里光醋炙品HPLC指纹图谱

Figure 3 HPLC fingerprints of vinegar processedS.scandensBuch.Ham

图4 千里光生品对照指纹图谱

Figure 4 Control fingerprints of the rawS.scandensBuch.Ham

图5 千里光醋炙品对照指纹图谱

Figure 5 Control fingerprints of the vinegar processedS.scandensBuch.Ham

表4 千里光生品共有峰的相对保留时间

表5 千里光生品共有峰的相对峰面积

表6 千里光醋炙品共有峰的相对保留时间

2.4.2 相似度评价 由表8～9可知，生品与其对照图谱的相似度为0.990～0.999，醋炙品与其对照图谱相似度为0.818～0.997，表明除醋炙品G1批(相似度为0.818)外，10批千里光生品与醋炙品相似度均>0.987，说明其质量相对稳定可控。

表7 千里光醋炙品共有峰的相对峰面积

表8 千里光生品指纹图谱的相似度计算

表9 千里光醋炙品指纹图谱的相似度计算

图6 千里光生品、醋炙品聚类分析树状图

2.4.3 系统聚类分析 由图6可知，聚类分析将10批千里光生品和醋炙品均聚为2类，千里光生品中，S9单独聚为一类，其他聚为一类；千里光醋炙品中，G3单独聚为一类，其他聚为一类。由于生品与醋炙品共有峰数量不同，聚类分析时，不建议将两者合并进行聚类分析。

2.5 多成分含量测定

由表10可知，不同采集地的千里光炮制前后各指标成分含量差异较大，醋炙千里光中各成分含量较生品均有所降低，与生品相比总黄酮含量降低了41.83%，总生物碱下降了38.97%，绿原酸下降了57.64%，金丝桃苷下降了51.28%，与指纹图谱测定结果吻合，表明炮制前后二次代谢产物有显著性变化。

表10千里光不同炮制品中多成分含量

Table10ThecontentofvariousconstituentsofrawandprocessedGuizhouS.scandensBuch.Ham (n=10) mg/g

样品总黄酮总生物碱绿原酸金丝桃苷生品 72.92±1.221.36±0.896.61±0.091.95±0.25醋炙品42.42±0.410.83±0.112.80±0.090.95±0.12

3 结论

比较了10批黔产千里光炮制前后的指纹图谱及多成分含量。结果表明，千里光中绿原酸、金丝桃苷、总黄酮及总生物碱含量与产地和采收期有关，醋炙品中绿原酸、金丝桃苷、总黄酮及总生物碱含量较生品均有明显降低，说明醋炙对千里光多成分含量产生了不同程度的影响。试验仅对千里光炮制前后的指纹图谱及含量进行了初步研究，针对千里光炮制前后的药理活性还有待进一步研究。