金舒文，王 琼，周 利，邹 燃，乐 薇，杨 敏，孙 滨，庞争争

（1.湖北中医药大学针灸骨伤学院 武汉 430061；2.湖北中医药大学附属武汉市中西医结合医院 武汉 430022）

高脂血症（HL）可独立诱发动脉粥样硬化性心脑血管疾病（ASCVD），对人类健康产生极大危害，造成了沉重的社会负担[1]。血脂水平过高可伤及血管内皮，经由相关炎症、免疫活动诱导，巨噬细胞（mø）形成泡沫细胞，促使脂质大量积聚于内皮下[2]。巨噬细胞膜蛋白三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）通过多种途径将胞内胆固醇和磷脂转运由胞内向胞外转移，降低胞内脂质蓄积，抑制炎性因子表达，减轻细胞壁炎性反应，对预防ASCVD 有重要意义。研究证实，其下游Janus 激酶2/信号传导和转录激活子3/锌指蛋白3636（JAK2/STAT3/TTP）信号通路活化，可引发若干相关瀑布反应，从而发挥脂质逆转运和抗炎的作用[3-4]。前期研究结果显示，针刺诱导HL 大鼠ABCA1 的表达上调，促进胆固醇逆转运，同时削弱mø 炎性活动[4][5][6]。同时，临床试验还发现，对HL 患者行丰隆穴针刺治疗，可使血脂水平显著下降[7][8]。然而尚无临床研究探讨针刺丰隆穴对HL 患者血脂调控的长期疗效及对血清mø信号通路JAK2/STAT3/TTP的调控机制。本实验依托武汉市卫生和计划生育委员会青年项目（WZ17Q01），通过测定治疗前后及治疗后1月、2月、6月高脂血症患者血脂水平，并检测巨噬细胞中JAK2、STAT3、TTP mRNA 及蛋白表达，进一步探究电针丰隆穴对高脂血症患者的临床疗效及对巨噬细胞信号通路的调节作用。以下为具体的研究。

图1 病例招募流程图

表1 三组高脂血症患者一般资料比较

1 临床资料

1.1 一般资料

自 2017 年 9 月-2019 年 2 月期间武汉市第一医院针灸科筛选出109 位HL 病人，其中90 位病人满足“痰浊阻遏证”标准，作为研究对象。由随机数字表，将这90位病人按1:1:1的比例分为对照组、药物组与电针组（具体如图1 所示）。基线期3 组患者一般情况比较无显著差异（P＞0.05），见表1。此项试验由武汉市第一医院临床研究伦理委员会审批通过。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

基于2016 修订版《中国成人血脂异常防治指南》[9]。在饮食正常时，经12 至14h 禁食后，对血脂进行测定，满足下述任1条及以上者，即可确诊HL：1)总胆固醇（TC）≥5.20mmol/L；2)低密度脂蛋白（LDL-C）≥3.4mmol/L；3)甘油三酯（TG）≥1.70mmol/L。

1.2.2 中医诊断标准

诊断标准参考《中药新药临床研究指导原则》所示“HL”部分[10]。在诊断痰浊阻遏证方面，标准如下：1)主症表现为肢体沉重麻木，体胖，头重似裹，易呕吐痰涎，胸闷脘痞；2)兼症表现为食量下降，食欲减弱，口淡，失眠等；3)在舌脉上，表现为舌淡胖且苔白腻，脉弦滑。上述主症若满足2 项，同时参考兼症、舌脉，可确诊此病。

1.3 纳入标准

①同时符合中西医诊断标准；②诊断为原发性高脂血症，年龄在30 岁至70 岁之间的患者；③2 周内未服用降脂药物，血脂水平仍符合诊断标准者；④自愿加入本试验积极配合并签署知情同意书者。

1.4 排除标准

①妊娠或哺乳期的女性患者，对降血脂药物存在过敏反应患者；②6 个月内有心脑血管意外经历，包括脑梗死、急性心肌梗死、曾行重大手术、重度创伤人员；③当前服用甲状腺素、肝素等对血脂代谢存在影响的药物的患者；④近14天内接受其他降脂疗法的患者；⑤伴发其它系统（如包括泌尿、心血管、消化与呼吸系统等）严重原发性疾病患者；⑥精神疾病患者。

远看，菊花是粉紫色的。它是那么的优雅，又是那样的可爱；近看，粉红色的花瓣中还有一点点惹人喜爱的嫩黄色。小小的花朵，玲珑可爱，就像一只只粉紫色的小蝴蝶。

1.5 剔除标准

①入组后，发现同纳入标准相悖或同排除标准相符的患者；②研究期间，有对试验安全性或疗效产生明显干预性的因素存在者。

1.6 脱落标准

①研究过程中出现死亡或病情恶化的患者；②研究过程中拒绝继续参与的患者；③发生严重副作用或不良事件的患者。。

2 治疗方法

2.1 电针组

选取双侧丰隆穴。患者取仰卧位，充分暴露双下肢，局部常规消毒后，将0.32mm*50mm 无菌针灸针（“健卫仕”牌，型号S3210，购自中美合作泰成科技发展有限公司）垂直刺入皮肤，进针深度约40mm，平补平泻法得气。同时取两侧丰隆穴近心端0.5cm 左右位置，将辅助针垂直刺入，约15mm 左右深度。双下肢皆连接韩氏穴位神经仪（型号为LH202H，购自北京华卫公司），负极连接丰隆穴，正极连接辅助针，直流电，等幅疏密波，频率2/100HZ，8-12mA，使患者舒适耐受，留针30 分钟。治疗频次为1 次/天，每周6 天不间断针刺，共针刺8周。

表2 引物序列

2.2 药物组

予以患者血脂康胶囊（批号为20171158，购自北京北大维信公司）口服，2 粒/次，2 次/天，共连续治疗8周。

2.3 对照组

患者取仰卧位，充分暴露双下肢，选取双侧丰隆穴与足三里穴连线中点作为针刺点，保持与皮肤垂直，快速进针，进针深度约40mm 左右。同时取该点近心端约0.5cm 左右位置，将辅助针垂直刺入此部位，保持15mm左右的深度。电针操作方法同电针组。

2.4 生活处方

电针组、药物组、对照组三组患者皆行低脂饮食，调整生活方式，进行适度锻炼，对可引发心血管病的因素加以有效控制，诸如限盐、戒烟与限酒等。同时告知患者治疗过程中忌行对研究结果存在干扰性的其他药物与干预措施。

3 疗效观察

3.1 检测指标

3.1.1 血脂检测

3.1.2 血清巨噬细胞内JAK2、STAT3指标检测

待完成治疗，采集静脉血，并移至肝素钠试管内，充分混合。离心处理（期间转速设定为2000 r/min）10min 后，再将上层血清5ml 移入EP 管内，存放在-80 ℃环境中，待用。对已解融的细胞悬液离心处理，随后加入完全培养基中，接受重悬处理，最后置入CO2 培养箱内培养。等细胞融合90%时，将旧培养基清理掉，PBS 洗涤1 遍，再将适量胰蛋白酶加入其中，1-5min 消化处理，之后对细胞行吹打处理，细胞得以悬浮。用处于对数生长期的细胞进行培养。向12 孔板（含1ml的1640培养基，但不含FBS）内铺装THP-1，经随机方式，归入对照组、药物组与电针组，各自添加不同病人的0.25ml血清，进行1d联合培养。

借 助 RT-PCR 技 术 ，对 3 组 人 THP-1 源 mø 中STAT3、JAK2、TTP mRNA 含量展开测定。在 mø 总RNA 提取方面所借助的工具为Trizol RNA 试剂盒。借助分光光度法，对RNA 浓度展开测定，再根据逆转录说明书所示，用PrimeScript TM RT Master Mix 逆转录RNA。以GAPDH 为内参，测定引物的融解曲线并统计 Ct 值，对 3 组细胞 STAT3、JAK2、TTP mRNA 含量进行实时PCR定量分析。各需检样本皆设置3管平行管。以公式ΔCt=[Ct]-[Ct(GAPDH)], ΔΔCt=[ΔCt (实验组)]-[ΔCt(对照组)]，采用2-ΔΔCT 法，计算实验组目的基因相对于对照组原始拷贝数的倍数差异，即相对mRNA 水平表达量。引物序列见表2。

免疫印迹法（Western Blotting）：提取3组mø蛋白，同时借助BCA 蛋白浓度检测试剂盒，完成对浓度的测定。对蛋白实施SDS-PAGE 电泳处理，再借助湿转法将蛋白向PVDF 膜上转移，接着在室温中，于脱色摇床上由脱脂牛奶(5%)封闭1h。加入JAK2、TTP 与STAT3一抗，稀释（1:1000），4℃下孵育过夜。待完成洗膜，加入山羊抗兔二抗（标记物为辣根过氧化物酶），稀释（1:3000），再于室温中，进行0.5h 的孵育处理，接着洗膜。待完成免疫作用，将膜取出，开始ECL 发光、显影与定影处理。之后整理去色，再借助Alpha 处理系统，完成目标条带光密度的分析。通过灰度值（目的条带）/灰度值（ACTIN）计算各组目的条带与内参条带的光密度比值，来计算相对蛋白表达量。

3.2 疗效评价标准

参照临床药物研究指导原则[15]。显具体标准如下：1）显效。待治疗完成，血脂方面符合下述任1 条：TC 减少≥20%，HDL-C 增高≥0.26 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 减少≥20%，TG 减少≥40%。2）有效。待结束治疗，血脂方面符合下述任1 条：TC 减少处于10%至20% 范围，TG 下降 20%～40%，HDL-C 上升 0.104～0.26 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 下降 10%～20%；3）无效。不符合有效条件；4）恶化。待治疗结束，血脂方面符合下述任 1 条，TC 增高≥10%，TG 上升≥10%，HDL-C 下降≥0.104 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 增高≥10%。总有效率为“显效”例数、“有效”例数之和在总例数中的占比。

3.3 统计方法

各项数据统计分析均借助SPSS26.0。计量数据若呈正态分布，描述形式即为均数(`x)±标准差(s)。在比较3组间血脂水平，实施重复测量方差分析法；在比较蛋白与mRNA 水平，实施单因素方差分析法，同时采用LSD 两两对比；组内对比，采用配对t 检验。分析计数数据，采用卡方检验。若分析结果为P＜0.05，提示存在统计学意义。

4 结果

4.1 各组有效率

通过表3 可见，在总有效率方面，对照组、药物组各为0%、86.6%，电针组总有效率为83.3%。两组经X2检验比较无明显差异，电针治疗与药物治疗效果相当。

表3 各组患者临床疗效比较［例（%）］

表4 各组患者治疗前后血脂结果测定比较（mmol·L-1，）

表4 各组患者治疗前后血脂结果测定比较（mmol·L-1，）

注：与同组治疗前比较，*P ＜ 0.05；与对照组比较，#P ＜ 0.05

LDL 3.93±0.45 2.59±0.47*#1.34±0.62#3.89±0.29 2.56±0.36*#1.33±0.47#3.88±0.34 3.93±0.35-0.05±0.49组别电针组30例数药物组30对照组30时间治疗前治疗后差值治疗前治疗后差值治疗前治疗后差值TC 6.11±0.61 5.14±0.51*#0.97±0.88#6.24±0.33 5.00±0.50*#1.24±0.58#6.01±0.59 6.06±0.66-0.05±0.39 TG 3.63±0.55 2.11±0.71*#1.52±0.50#3.65±0.43 1.91±0.55*#1.75±0.52#3.79±0.27 3.79±0.35-0.00±0.39 HDL 1.18±0.13 1.16±0.19 0.02±0.16 1.20±0.14 1.23±0.20-0.02±0.20 1.12±0.11 1.23±0.13-0.11±0.11

4.2 各组患者血脂水平变化

4.2.1 治疗后各组患者血脂水平比较

基线期各组患者在血清TC、TG、LDL-C 与HDL-C水平比较上，P＞0.05，未见显著差异。在组内比较方面，药物组、电针组治疗后的TC、TG 与LDL-C 水平较治疗前均显著下调（P＜0.05），且两组下降水平未见显著差异（P＞0.05）。治疗后药物组和电针组血脂水平较对照组有显著差异（P＜0.05）。对于对照组而言，血脂水平各项指标无显著差异（P＞0.05）（表4）。

4.2.2 随访期各组患者血脂水平比较

由可见，随访期间，电针组治疗后1 月、2 月与6月时的LDL、TC 与TG 水平较治疗后未见显著差异；药物组治疗后2 月、治疗后6 月TC、TG、LDL 与治疗后比较差异有统计学意义，分别相较于对照组仍有明显差异。结果表明治疗后2 月、治疗后6 月药物组TC、TG、LDL 升高，血脂水平出现反弹，而电针组未见反弹。药物组和电针组治疗前后及随访HDL 变化差异无统计学意义，说明两组对HDL的无明显调整作用。对照组干预前后各项指标比较无统计学意义（表5）。

4.3 各组巨噬细胞JAK2mRNA、STAT3 mRNA、TTPmRNA表达水平比较

治疗后药物组和电针组患者JAK2mRNA、STAT3mRNA、TTPmRNA 表达均明显高于对照组；电针组 JAK2mRNA、STAT3mRNA、TTPmRNA 表达无明显差异。电针组相比于药物组未见明显差异图2。

表5 各组患者随访血脂结果测定比较（mmol L-1，）

表5 各组患者随访血脂结果测定比较（mmol L-1，）

注：与同组治疗后比较，*P ＜ 0.05；与对照组比较，#P ＜ 0.05

LDL 2.59±0.47#2.61±0.47#2.55±0.43#2.66±0.48#2.56±0.36#2.64±0.42#3.11±0.39*#3.29±0.38*#3.93±0.35 4.07±0.32 3.89±0.57 3.92±0.53组别例数电针组30药物组30对照组30时间治疗后治疗后1月治疗后2月治疗后6月治疗后治疗后1月治疗后2月治疗后6月治疗后治疗后1月治疗后2月治疗后6月TC 5.14±0.51#5.04±0.31#5.02±0.19#5.08±0.16#5.00±0.50#5.32±0.43#5.77±0.43*#5.83±0.37*#6.06±0.66 6.04±0.51 6.28±0.44 6.34±0.41 TG 2.11±0.71#2.09±0.63#1.95±0.65#2.11±0.64#1.91±0.55#2.14±0.46#2.73±0.49*#2.88±0.56*#3.79±0.35 3.88±0.43 3.96±0.32 3.90±0.26 HDL 1.16±0.19 1.17±0.20 1.12±0.20 1.11±0.19 1.23±0.201.29±0.16 1.21±0.20 1.18±0.22 1.23±0.13 1.21±0.28 1.26±0.26 1.24±0.30

图2 巨噬细胞与对照组、药物组及电针组人血清共培养实时定量聚合酶链反应的JAK2mRNA、STAT3 mRNA、TTPmRNA表达量比较（，30例患者/组）

图3 各组巨噬细胞JAK2、STAT3、TTP蛋白表达

4.4 各组巨噬细胞JAK2、STAT3、TTP 蛋白表达水平比较

图4 巨噬细胞与对照组、药物组及电针组人血清巨噬细胞共培养的JAK2、STAT3、TTP蛋白相对表达量比较（，30例患者/组）

通过图 3、4 可见，在治疗后 STAT3、JAK2 与 TTP的蛋白表达水平上，相较对照组，药物组和电针组均显著升高（P＜0.05）；且电针组和药物组未见显著差异（P＞0.05）。

5 讨论

祖国医学中，自黄帝内经便有对高脂血症相关叙述，如《素问·通评虚实论》中:“凡治消痹、仆击、偏枯萎厥，气满发腻，甘肥贵人，则膏粱之族也。”其与脾虚痰浊关系最为密切，病机总属本虚标实[16][17]。目前血脂异常指南多推荐口服降脂药物治疗，如中成药物血脂康，由发酵而成的红曲精制而成，具有消食、活血、除湿的功用，临床研究证实可降低高脂血症患者TC、TG、LDL-C，且升高HDL-C 作用优于他汀类药物[8][18]。但部分患者对该类药物不耐受，存在肝肾功能损害、胃肠道反应等不良反应。《玉龙歌》有云：“痰多宜向丰隆寻”，丰隆穴为足阳明胃经络穴，别走足太阴脾经，沟通脾胃经气，具有健脾、化痰、利湿之功，为治痰之要穴，自《灵枢》以来历代医家多选用丰隆穴治疗痰浊病证。目前临床研究已表明针刺治疗高脂血症疗效明确，具有潜在优势，文献研究分析以电针丰隆穴使用频次最高[19-22]。故本研究以电针丰隆穴为干预措施，与口服血脂康及非经非穴针刺相比较，探究电针丰隆穴治疗高脂血症的有效性。

当处于高血脂状态时，在各种生长因子、趋化因子，氧化 LDL（ox-LDL）介导下，单核细胞会向 mø 分化，进而吞噬在内皮下积滞的脂质，导致若干相关炎性、免疫活动的发生，进而形成动脉粥样硬化。mø 膜转运蛋白ABCA1 调控胞内磷脂和胆固醇与细胞表面的Apo AI结合，促进脂质的流出，较少胞内脂质负荷，并激活下游JAK2/STAT3 通路。JAK2/STAT3 发挥前馈机制，增强ABCA1 与ApoAI 的活性结合，且直接调控ABCA1 的基因表达[24-25]。同时JAK2/STAT3 促进炎性因子的降解，发挥抗炎作用[26-27]。TTP 作为JAK2/STAT3 的下游信号，通过降解炎性因子mRNA 的富腺嘌呤、尿嘧啶区域，进而调控炎性因子蛋白的表达。已有研究证实，上调JAK2/STAT3/TTP 通路，可显著降低炎性因子（如TNF-α、IL-6、MCP-1）的产生[4,28]。故而，信号途径JAK2/STAT3/TTP 能够增强脂质逆转运效率，并减轻炎性反应，达到防止动脉粥样硬化的作用。

通过此项研究证实，电针丰隆穴可显著降低患者血脂，显著下调TC、TG 与LDL-C 水平，同时可获得较为稳定的长期疗效，相较药物疗法体现出明显优势。此疗法同时可使 mø 内 TTP、JAK2 与 STAT3 三者蛋白、mRNA 表达量大幅上调，具有一定的防治动脉粥样硬化的作用。其降脂疗效可能与通过调控信号途径JAK2/STAT3，增强胆固醇逆转运效率相关。此研究以及既往已有研究结果皆显示，同药物降脂比较，针刺丰隆穴疗效更稳定，同时不会引发肝酶上升等不良作用，具备有效性与安全性[7][29]。但针刺疗法存在一定时间、经济成本，本次试验中患者需每日行针刺治疗，因此为保持患者依从性，试验过程中采取以下措施：首先，试验前向患者宣传前期研究已证实针刺降血脂疗效，且有研究表明疗效与患者依从性明确相关，使患者对针刺疗效产生认可[30]；再者，试验前做好充分的知情同意，使受试者主动表态服从实验，要求进入试验；除此之外，试验过程中设有专门诊室，保证研究人员固定，对每位患者建立完整的档案信息，并与患者保持良好的医患沟通，获得受试者充分信任，在试验过程中若患者提出相关疑问或出现焦虑心理，充分解释并鼓励继续坚持。但本试验受试者样本数较少，结果可能存在一定偏移，且仅对JAK2/STAT3/TTP 信号通路进行了初步研究。今后需开展更多的大样本临床研究，且对其上游信号以及下游炎性因子的作用值得进一步探讨。但此项研究所涉及样本量有限，结果有偏移风险，同时仅较为表浅地分析了信号途径JAK2/STAT3/TTP。未来应进行更为广泛的大规模临床实验，同时更为深入的挖掘其上游信号与下游炎症介质的影响。