郑文江 ，彭紫荆，严 倩，谢富淇，詹少锋 ，杨柳柳，刘小虹，江 勇，庄轰发＊＊

（1. 广州中医药大学第一临床医学院 广州 510405；2. 广州中医药大学第一附属医院广州 510405；3. 深圳市中西医结合医院 深圳 518104）

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见慢性疾病，两大特征是持续存在的呼吸道症状和气流受限[1]。每年，COPD 导致全世界近300 万人死亡，而在中国多达1 亿人可能患有COPD[2]，约占全球COPD 病例总数的25%。虽然在症状的治疗和急性加重的预防方面取得了进展，但改善疾病进展或影响死亡率的进展很少，因此仍然需要对导致COPD 的复杂疾病机制有更好的了解[3]。在过去的10 年中，科学家们为寻找针对COPD 炎症的新疗法做了大量的工作，但效果并不明显[4]，这可能与炎症和相关临床表型的复杂性密切相关，仅仅针对单个炎症途径或机制可能不足以持续抑制所有COPD 患者的炎症[5]。网络药理学和系统生物学可能有助于我们从整合信息的角度了解COPD 的临床表现并确定新疗法的分子靶标[6]。

方剂的证候效应及其多靶点作用的科学阐释是目前方剂现代研究的关键问题[7]。网络药理学集合了高通量数据整合、数据挖掘、靶点预测、以及模拟实验室等研究手段，从整体分析中药复方“多成分、多靶点”的作用机制[8]，也能呈现特定疾病相关的“活性成分-靶点-通路”，其系统性、整体性的特点与中医中药整体观、辨证论治的原则和中药复方治疗疾病的手段等一脉相承[9]。网络药理学概念的提出[10]和中医药网络药理学方法为中医从经验医学到循证医学系统的转化提供了新的研究范式[11]。

培土生金方是广东省名中医刘小虹教授及其团队发明的一种治疗稳定期慢性阻塞性肺疾病的中药复方[12]，由五指毛桃、茯苓、白术、太子参、紫苏子和苦杏仁组成，已经获得发明专利且开发为广州中医药大学第一附属医院院内制剂，命名为肺康颗粒，该方以培土生金法为原则，宗四君之义，运用岭南地区道地药材，用方精简，配伍精良，具有良好的健脾益肺、化痰平喘之功，多年来在临床上广泛运用于COPD 稳定期患者[13-14]，取得较好疗效。本文基于所在课题组已有的实验研究和临床研究成果，包括运用网络药理技术识别培土生金法对COPD 水通道蛋白的机制研究、中医药强省医院中药制剂“肺康颗粒”建设项目等，对课题组研究成果进行补充阐述，运用网络药理学和生物信息学的方法，尝试从中药复方多靶点、多通路作用的角度，探讨培土生金方对COPD潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 收集潜在活性成分及其作用靶点

口服生物利用度（OB）和类药性（DL）是中药化学成分的重要参数，在TCMSP[15](http://tcmspw.com/),TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid)[16],TCMDatabase@Taiwan[17]和文献数据库中，根据OB＞30%、DL＞0.18的标准，使用ADME参数[18]筛选出可能的药物小分子，基于TCMSP 数据库和Drugbank 数据库[19](https://www.drugbank.ca/)，预测化学小分子对应的靶蛋白，筛选培土生金中药复方肺康颗粒（PTSJ）的潜在活性成分及其相应的靶点信息。

1.2 筛选候选靶点

利用UniProt 数据库[20]中UniProtKB 搜索功能将获得的潜在活性成分对应的蛋白靶点名称转换为基因靶点名称。在CTD数据库[20]的关键词搜索功能中选择Disease 并输入 Chronic obstructive pulmonary disease，获得疾病相关基因名称，与上述经Uniprot转换的靶点基因名称进行互相映射，得到培土生金方肺康颗粒作用于COPD的候选靶点。

1.3 活性成分-靶点（C-T，Compound-Target）网络的构建及分析

将整理得的活性成分及其相应的靶点对应关系导入Cytoscape 3.7.0软件[22]进行活性成分-靶点网络构建，并使用工具中的NetworkAnalysis[23]进行网络拓扑分析，将靶点的Degree 值进行排序，得到潜在核心靶点。Cytoscape 是一款功能强大的网络图编辑软件，采用图形化显示网络方式进行分析和编辑，主要功能包括构建网络、设计和图形绘制，支持TXT、SIF、GML 等多种网格描述格式，广泛应用于生物分析领域，将映射关系及数值对比可视化。在网络拓扑分析中，节点代表化合物或靶点，连接的线代表之间的反应，其中，节点的度（Degree）是指网络中直接与该节点相连的边的数目，介数中心性（Betweenness centrality）是指一个节点的介数为网络中所有最短路径中经过该点的数量比例，此二者皆为重要的拓扑参数，数值越大，则表示该点在网络中地位越重要。

1.4 蛋白质相互作用（PPI，protein-protein interaction）网络的构建及分析

STRING 数据库（http://string-db.org）[24]是基因、蛋白质相互作用关系数据库，包括1100多个物种的5200多万蛋白质，可进行已知蛋白质和预测蛋白质之间的相互作用，在蛋白质水平的研究上被广泛应用。利用STRING 数据库的Multiple proteins 功能，将获得的蛋白互作关系保存，将候选作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用文件中的 node1、node2、combined score 导入Cytoscape 3.7.0 软件构建PPI 网络，进行可视化处理，并使用工具中的NetworkAnalysis 进行网络拓扑分析，主要根据结果中的Degree 值的大小筛选，与上一步合并，获得核心靶点。

1.5 潜在靶点的基因注释

使用R 语言及org.Hs.eg.db 数据包转换核心靶点的 entrezID，再使用 ClusterProfiler 包[25]对靶点其 GO 功能[25]及KEGG 通路[27]进行基因注释的富集分析，得到核心靶点在基因功能及信号通路的注释。

1.6 GEO数据集靶点验证

下载GEO 数据库芯片数据，数据集的编号为GSE76925[28]，该 数 据 集 151 例 样 本 ，其 中 111 例 为COPD 患者样本，40 例为控制对照组的样本。下载编号为GSE76925 数据集的原始数据文件，使用R 语言软 件 的 affy 包[29]（Version 3.9）进 行 读 取 ，以 RMA（robust multi-array average）方法进行标准化预处理，包括背景校正、标准化、归一化等预处理，利用平台注释文件对探针进行注释，剔除没有匹配到基因的探针；对于不同探针映射到同一基因，则选取不同探针的均值作为此基因的最终表达值。将样本分为两组，疾病组和健康组，对COPD 患者组（COPD）和健康对照组（HC）样本的表达，利用limma包[30]（Version 3.9）计算基因表达差异的P值和表达Fold Change 值，进而选取P ＜0.05 且|log2FC|＞1（2 倍关系）作为筛选显著差异表达基因的阈值。

2 结果

2.1 培土生金方的潜在活性成分

通过 TCMSP、TCMDatabase@Taiwan、TCMID 和文献数据库检索，分别查找肺康颗粒的化学成分，将上述3 个数据库查到的化学成分汇总，并删除重复化学成分，作为潜在活性成分（其中，五指毛桃为岭南特色道地药材，是肺康颗粒中药复方的君药，因此纳入已经报道的所有化学成分作为潜在活性成分），并收集所有靶点信息，共获得83个潜在活性成分。

2.2 培土生金方的潜在候选靶点

利用UniProt 数据库中UniProtKB 搜索功能，限定检索靶点范围为“Homo sapiens(Human)”，将靶点逐个输入，转换为规范名字，共有1112 个靶点信息，其中，太子参82个潜在靶点，茯苓26个潜在靶点，白术17个潜在靶点，紫苏子156 个潜在靶点，苦杏仁178 个潜在靶点，五指毛桃653个潜在靶点，靶点数量及其具体分布见表1。在CTD 数据库中，输入“Chronic obstructive pulmonary disease”，收集目前已知的COPD 相关靶点，并将肺康颗粒有效活性成分中的基因靶点与其进行比对匹配，筛选得出肺康颗粒有效活性成分中治疗COPD的相关靶点，共获得193个潜在候选靶点。

表1 培土生金方的潜在活性成分及其OB和DL值

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图1 活性成分-靶点网络图

2.3 C-T网络分析

将整理得的活性成分及其相应的靶点对应关系导入Cytoscape3.7.0 软件进行活性成分-靶点网络构建，并使用工具中的NetworkAnalysis 进行网络拓扑分析，将靶点的Degree 值进行排序，筛选Degree 值≥3的作为潜在核心靶点，得到83潜在核心靶点。网络拓扑分析（图1）中，含灰色环的圆形节点代表化合物，橙色矩形代表靶点，连接的线代表之间的反应；同时具有两种或两种以上颜色的表示各中药的共有成分；各节点的大小与度值大小呈正相关关系：靶点中图形越小表示度值（Degree）越小，图形越大表示度值越大，发生的反应越多。连接的线的粗细与该边线的介数中心性（Betweenness Centrality）呈正相关关系，数值越大，边越粗，则表示该点在网络中地位越重要。

2.4 PPI网络分析

在STRING数据库输入83个潜在核心靶点的基因名称，限定物种为“Homo sapiens”，对所有靶点进行PPI 分析，获得初始PPI 关系，调节可信度为7.0，获得蛋白质之间相互作用的评分及相关数据分析，最后把获得的蛋白互作关系保存为TSV格式。

导出源文件后，将数据进行整理后导入cytoscape3.7.0 软件中，进行进一步网络拓扑分析，筛选Degree 值 ≥ 3 的靶点，与上一步NetworkAnalysis 网络拓扑分析结果整合，获得77 个核心靶点（表2），PPI可视化处理（图2）。

表2 培土生金方的潜在核心靶点

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图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.5 潜在靶点的基因注释结果

首先，是基因功能的注释，把培土生金方有效活性成分中治疗COPD 的193 个候选靶点分别通过ClusterProfiler（pV＜0.05，qV＜0.05）进行 GO 富集分析。图中，颜色从蓝色到红色表示P值从小到大，即越红表示条目的显著度越高。

结果显示，对候选靶点的基因功能主要包括：对有毒物质、细菌起源分子、脂多糖、异源生物刺激、细胞对药物、细胞外刺激、营养水平的反应和活性氧代谢等生物学过程，包括突触后膜、突触前膜、小窝和膜区等细胞组分，包括核受体活性、铵离子结合、蛋白质异二聚活性、肾上腺素受体活性、类固醇激素受体活性、G蛋白偶联的胺受体活性、转录因子活性等分子功能（图3）。

图3 GO富集分析的生物过程、细胞组分和分子功能结果

图4 KEGG富集分析的通路结果

然后，是基因通路的注释，把培土生金方有效活性成分中治疗COPD 的193 个候选靶点通过ClusterProfiler（pV＜0.05，qV＜0.05）进行 KEGG 通路富集分析。

结果显示，富集的信号通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK 信号通路、TNFα信号通路、HIF-1 信号通路、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等，其中富集了最多的靶点是PI3K-Akt 和MAPK 信号通路，分别是31个和28个（图4）。

接着，为了进一步探索培土生金方作用于COPD的靶点在相关通路中所发挥的作用及其间相互关系，把靶点名称转换成entrezID 后，通过KEGG 数据库把靶点映射到信号通路上，其中紫色标识即为输入靶点。利用KEGG 数据库中KEGG Mapper 获取相关通路，挑选出上述核心基因进行标记，梳理反应过程，同时进行文献检索，结合专家意见，进行科学的筛选与分析，最后进行整合得到最终通路。主要信号通路涉及PI3-AKT、NF-κB、AMPK、Th17 CELL 等，其中PI3-AKT信号通路见图5。

2.6 作用靶点的验证结果

根据方法学部分所述，下载GSE76925 数据集，经过筛选一共获得差异基因771 个，其中上调基因49个，下调基因622个，差异基因的火山图见图6，将所获得的差异表达基因与肺康颗粒对COPD 的潜在作用靶点互相映射，交叉验证靶蛋白取交集获得8 个共有靶蛋白，分别是：PPP3CA、NCOA1、IKBKB、PLA2G4A、CAT、BCHE、HSPA5，可能为培土生金方主要活性成分重要成分治疗COPD 的潜在关键靶蛋白；另外，差异表达基因排名前六位的基因分别是：AGR3、ESM1、SLC12A2、KLF5、EMP2、SUMO1，可作为COPD 的潜在标靶。

3 讨论

近年来的临床研究表明，培土生金方在COPD 患者中具有一定疗效，在减轻患者临床症状、改善肺功能、减轻气道重塑有一定作用[31]，改善COPD 稳定期患者咳嗽、气促、喘息、易感冒、自汗、食欲减退等COPD患者证候，可能与通过降低外周血IL-8水平而减轻气道炎症反应有关[32]，培土生金法联合西医常规方案治疗COPD 稳定期肺脾气虚证患者，在咳痰、纳呆、腹胀等症状方面，疗效优于单纯西医治疗，临床症状改善可能与IL-4 水平下降相关[33]。此外，循证医学系统评价和Meta分析的结果也表明，中医理论培土生金法指导下的COPD 患者治疗中，具有一定优势，能够提高临床治疗COPD 总有效率[34]，改善COPD 稳定期患者的肺功能，提高患者的生活质量和营养状态[34]，但此类循证医学证据同时也指出现有研究质量偏低，需开展更高质量的RCT加以验证。

图5 培土生金方在PI3-AKT信号通路中预测的作用靶点

图6 差异表达基因的火山图

3.1 培土生金方具有多个潜在活性成分

通过网络药理学的方法，发现培土生金方中多个活性成分可以作用于同一靶点，单个活性成分也可以作用于多个靶点，通过多条信号通路协同发挥作用。其中，五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是岭南地区常见的药用植物，有较高的药用价值，其性平味甘，具有健脾补肺、行气利湿、舒筋活络、止咳平喘等功效，临床主用于治疗脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、病后体弱、风湿痹痛等病证。五指毛桃含有补骨脂素（Psoralen）、木犀草素（Luteolin）、芹菜素（Apigenin）、异补骨脂内酯（Ispsoralen）等化学成分，这些物质都具有较强的清除自由基能力，有较好的抗氧化应激活性[36]，具有多种呼吸系统疾病的保护作用。补骨脂素（Psoralen）能够抑制NF-κB 的活化，减少促炎因子及趋化因子的分泌[36]，补骨脂素和异补骨脂素还能够下调TGF-β1；佛手柑内酯（Bergapten）显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞向损伤部位的募集，并促进中性粒细胞和巨噬细胞从伤口部位的清除，具有潜在抗炎和促分解活性[38]，其抗炎特性[38]，可能是炎症治疗的潜在小分子药物；NF-κB信号通路主要参与免疫和炎症反应相关信号通路，伞形花内酯（Umbelliferone）抑制MAPK/NF-κB 通路分子的表达[40]，减弱肺组织中炎性细胞的浸润，并减少脂多糖（LPS）诱导的炎性细胞因子的产生，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 途径的激活，对 LPS 诱导的 ALI 发挥了重要的保护作用[41]；柚皮素（Narigenin）减少了LPS 处理的正常人支气管上皮中NF-κB 和MAPK 信号通路的激活，从而降低了TNF-α和IL-6的分泌以及mRNA表达，对支气管上皮的损伤具有保护作用[42]；芹菜素对百草枯诱导的急性肺损伤和免疫毒性具有保护作用[43]；木犀草素通过下调miR-132 减轻LPS 诱导的NF-κB 信号通路的激活，对支气管肺炎的炎症性损伤具有保护作用[44]。大黄素（Emodin）通过抑制NF-κB、p38 MAPK 等通路的活性，来抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和基质金属蛋白酶-9的表达，从而发挥抗炎作用[45]。

太子参（Pseudostellariae Radix）的多糖成分被认为是主要的活性成分，具有免疫调节和抗疲劳作用[46]；茯苓（Poria cocos）主要含有的化学成分是多糖类、三萜类、甾醇类等，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化等药理作用[47]；白术（Atractylodes macrocephala）含有挥发油、多糖和内酯类成分等活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、调节胃肠功能等药理作用，抑制细胞中TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表达，对慢性支气管炎、过敏性鼻炎和哮喘具有免疫调节作用[48]；苦杏仁（apricot kernel）的主要化学成分有苦杏仁苷、脂肪油、多种维生素及矿物质元素等，具有镇咳平喘、抗炎止痛的药理作用，苦杏仁苷还能通过抑制NF-κB 和NLRP3 信号通路对LPS 诱导的急性肺损伤起到保护作用[48]；紫苏子（Perilla seeds）中的β-胡萝卜素通过抑制巨噬细胞中的 NF-κB，JAK2/STAT3 和JNK/p38 MAPK 信号通路来减轻LPS诱导的炎症[50]。

3.2 培土生金方涉及多个潜在核心标靶及信号通路

结合图1 和表2 可知，培土生金方潜在核心标靶排名前 10 位的是：AKT1、IL6、TP53、VEGFA、JUN、MAPK1、CASP3、TNF、ESR1、NOS3，富集的信号通路主要涉及PI3K-Ak、MAPK、TNFα、HIF-1、NF-κB 及小细胞肺癌和非小细胞肺癌等。其中，①血管生成因子可激活PI3K/AKT/mTOR 的靶标启动血管生成过程，白细胞介素6（IL6）是间接促进血管生成的细胞因子，血管内皮生长因子（VEGF）是直接促进血管生成的细胞因子，其在缺氧条件下作为缺氧诱导因子（HIF-1α）的作用而释放，HIF-1α还可通过激活EGFR/PI3K/AKT途径上调炎症因子的表达，促进COPD 的炎症反应[51]，并引起支气管细胞的重新调节和炎症，细胞的重新调节和炎症导致例如COPD、哮喘、纤维化和肺癌等各种肺部疾病的发展[52]，表明VEGF 的过表达与肺部疾病之间存在相关性，培土生金方可能通过减少VEGF 的过表达而对COPD 起到治疗作用，抑制PI3K/AKT 的信号传导还可能有助于COPD 肺泡损伤得以修复[53]。②气道粘液分泌是保护宿主的重要先天免疫反应，但是主要由MUC5AC 组成的粘液分泌过多和分泌过多是COPD 的重要危险因素，通过抑制NF-κB 信号通路的转录活性及其上游效应子的磷酸化，还可能降低TNF-α诱导的 MUC5AC mRNA 和蛋白的表达水平[53]，培土生金方的多个主要成分涉及调控NF-κB 信号通路，可能是其对COPD 作用的机理之一。③TNFα通过诱导炎性细胞积聚，刺激炎性介质的产生，引起氧化和亚硝化应激，气道高反应性和组织重塑，在COPD 的病理过程中发挥多种作用[55]，干预TNFα的靶向剂可能成为COPD 炎症的治疗标靶。④培土生金方还在癌症方面显示出一定的潜力，富集到肺癌相关信号通路，如五指毛桃的主要成分之一木犀草素被发现具有抗癌作用，通过抑制肿瘤细胞的增殖，免受致癌性刺激和激活细胞周期阻滞，通过不同的信号传导途径诱导凋亡，从而在体内外阻断癌症的发展[55]，木犀草素和槲皮素还能促进癌细胞的转移[57]。

为了进一步探讨和验证靶点预测的准确性，从基因表达数据库（GEO）下载COPD 相关的基因芯片数据集，筛选COPD 患者和健康对照组之间的差异表达基因：AGR3、ESM1、SLC12A2、KLF5、EMP2、SUMO1，可作为COPD 的潜在标靶，之后与网络药理学研究结果比对，获得8 个共有靶蛋白：PPP3CA、NCOA1、IKBKB、PLA2G4A、CAT、BCHE、HSPA5；其中，研究发现COPD患者的小气道和肺血管中（Krüppel-like factor 5）KLF5的表达上调[57]，并且可能参与了COPD 的组织重塑；研究发现，与健康受试者相比，诊断为COPD 患者的血浆中（丁酰胆碱酯酶）BCHE 的活性大大降低[59]，BCHE 活性的改变可能与COPD 患者的氧化和炎症过程有关，从而使这些酶成为COPD 疾病的标志物[60]，这些潜在靶点可能为培土生金方主要活性成分治疗COPD 的潜在关键靶蛋白。

动物实验研究表明，培土生金方复方活性成分干预COPD 大鼠，在其肺泡结构方面，降低IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 的含量，可能通过TLR4/NF-κB 信号转导通路干预炎症基因的表达，减轻COPD 大鼠的炎症反应[61]；增加COPD大鼠的Treg细胞表达，降低Th17相关细胞因子IL-17、IL-23 表达，进而平衡外周血中Th17/Treg 比率，减轻COPD 大鼠炎症反应[62]。临床研究表明，培土生金方复方还能降低COPD 患者诱导痰中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 的水平，一定程度改善患者肺功能、改善患者生存质量和减少急性发作次数[63]。

祖国医学理论体系五行学说认为，五脏相生相克，脾为肺之母，肺为脾之子，培脾土以生肺金。培土生金方以肺脾相关理论为指导，充分发挥中医药调治慢性疾病的优势，以中医培土生金大法为指导，根据按照中医君、臣、佐、使组方原理和临床经验方，逐渐筛选出五指毛桃、茯苓、白术、太子参、紫苏子和苦杏仁的六味药物组方。方中太子参补益脾胃中焦之气，五指毛桃益气通络，两者共为君药；茯苓健脾补中，宁心安神，白术补脾益气，燥湿固表共为臣药；杏仁泄肺降气，苏子降气平喘共为佐使之药；诸药合用，补益中焦脾胃，使肺脾之气充旺，达到平喘止咳的治疗目的，临床实践表明，该方具有多元化治疗稳定期COPD 的特点，可减轻COPD 患者的症状，改善其活动能力，提高生存质量。

从中药复方君臣佐使的角度分析，君臣佐使表明方中药物在方中的位置和治疗中的主次和协同拮抗关系，是药物配伍的基本原则，君药起主要治疗作用，臣药就是辅助君药加强治疗作用，因此，从理论上讲，君药的作用靶点最多，臣药次之，本文依据作用靶点的多少和君臣佐使的对应关系，进一步阐释中药方剂的配伍作用。培土生金方中君药五指毛桃预测出653个潜在靶点，太子参82个潜在靶点，两者靶点总共735个，占该复方总靶点的60%以上，据此推测是对COPD起到主要作用的药物组合；茯苓预测出26 个潜在靶点，白术预测出17 个潜在靶点，两者靶点总共43 个，茯苓白术共为臣药；苦杏仁潜在靶点178个，紫苏子潜在靶点156 个，两者靶点总共334 个，共为佐使药，靶点占复方总靶点30%，虽名义为佐使药，但是靶点数量仍较多，这与COPD 患者以咳嗽气喘为主证的临床特点相符，杏仁泄肺降气、苏子降气平喘，符合COPD的诊治特点，与中医理论药物配伍原则相一致。

本文采用网络药理学分析中药复方起效的作用机制，存在以下局限性：中药复方的作用是整体调节，本文采用单纯的各个成分的分析，且未将药物剂量考虑在内，未对复方配伍中的剂量关系层次进行探讨，难以综合评价中药方剂的配伍作用，有待进一步深入研究。

综上所述，培土生金方的多个潜在活性成分，可能通过AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、TNF 等多个核心靶点在PI3K-Akt、MAPK、TNFα、HIF-1、NF-κB 等多个信号通路，起到对COPD的治疗作用。本研究结论可为下一步的实验验证提供线索和思路，培土生金方对COPD的作用机制还需进一步的动物和细胞实验来证实。