刘 艺，郭金兴

（1. 牡丹江医学院药学院 牡丹江 157011；2. 牡丹江医学院附属红旗医院 牡丹江 157011）

宫颈癌（cervical carcinoma）是常见的威胁女性健康及生命的恶性肿瘤。国际癌症研究中心研究数据表明，2013 年世界范围内确诊宫颈癌病例约48.5 万，死亡23.6 万[1]。我国宫颈癌统计学研究数据表明，2009 年，我国宫颈癌发病率为12.96/10 万，死亡率为3.28/10万[2]。宫颈癌95%的病例是由高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染引起，其他危险因素如早婚、结婚次数过多、丈夫包皮过长、性伴侣过多、多产及初产年龄过早、人工流产次数过多、口服避孕药、吸烟与被动吸烟、机体免疫功能低下等[3-6]。目前宫颈癌的治疗仍以传统放化疗为主，而放化疗耐受已成为宫颈癌治疗失败、癌症转移和复发的主要原因之一[7]。近年来，中药治疗肿瘤以其多靶点、来源丰富、有效低毒的优势日益收到大多学者高度的重视。冬凌草甲素（oridonin）是唇形科香茶菜属植物冬凌草主要的抗癌有效成分，为贝壳杉烯类二萜。现代药理研究表明，冬凌草甲素对多种肿瘤有治疗作用如直肠癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]、肝癌[12]、食管癌[13]、卵巢癌[14]、胰腺癌[15]等，提示冬凌草甲素具有较好的抗肿瘤效果。也有研究表明，冬凌草甲素对人宫颈癌HeLa 细胞增殖具有明显的抑制作用[16,17]。然而有关于冬凌草甲素对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响鲜见报道。故此本研究观察了冬凌草甲素对HeLa 细胞迁移和侵袭能力及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响，为其治疗宫颈癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

人宫颈癌HeLa细胞（美国ATCC，货号：ZY-H066）接种于含10%热灭活胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、2%谷氨酰胺、100 μg·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素的RPMI-1640 培养液中培养。每48 h 更换新鲜培养液，待细胞融合度达80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.1.2 主要试剂

冬凌草甲素（纯度＞99.4%，美国Amresco，货号：28957-04-2）；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO，美国 SIGMA，货号：D5879-100ML）；RPMI-1640 培养基、FBS 和胰蛋白酶（美国 Gibco 公司，货号：12633、DXT-10099141、X4380）；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）；（美国 Abbkine 公司，货号：KTC011001）；TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（美国Ambion 公司，货号：xyG001-1）；Annexin V-FITC/PI 试剂盒（美国BD 公司，货号：556547）；鼠抗人β-catenin单克隆抗体（美国Abcam 公司，货号：xyKF682）；鼠抗人原癌基因（C-myc）单克隆抗体（美国Merck Millipore公司，货号：DXT-ST257261）；鼠抗人细胞周期素D1（Cyclin D1）和兔抗人GAPDH 多克隆抗体（美国Bioss公司，货号：bs-0623R-1，bs-0755R-1）；其它试剂均为进口或者国产分析纯。

1.1.3 主要仪器

Model 311 型CO2培养箱（美国Thermo Scientific 公司）；Bio-Tek ELX800 型多功能酶标仪（美国Bio Rad公司）；FACS CaliburTM流式细胞仪（美国BD 公司）；BX43荧光显微镜（日本Olympus公司）；Power PAC1000电泳仪（美国Bio Rad 公司）；Micropulser 电转仪（美国Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物配制

冬凌草甲素溶于 DMSO 配制成 160 μmol·L-1储备液，DMSO浓度≤0.1%且不诱导细胞增殖或者死亡。-20℃冰箱保存，临用时以RPMI-1640 培养液稀释到所需浓度。

1.2.2 CCK-8实验

严格按照CCK-8 检测试剂盒操作说明书进行HeLa细胞活力检测。将对数生长期HeLa细胞接种于96孔板，细胞密度为1.5× 104个细胞/孔。37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，待细胞贴壁后，实验组分别加入含不同浓度为10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素的RPMI-1640培养液100 μL，对照组加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640 培养液100 μL。每个剂量组均设6 个复孔。37℃、5% CO2及饱和湿度下培养。分别于12 h，24 h和36 h后终止培养，各孔均加入CCK-8试剂10 μL，混匀。37℃、5%CO2及饱和湿度下培养4 h。酶标仪检测450 nm 处的吸光度（optical density，OD）值，以未加入HeLa 细胞，未加入冬凌草甲素，但是加入CCK-8 试剂的培养空作为空白组。计算细胞活力，细胞活力（%）=（实验组的OD 值-空白组的OD 值）/对照组的OD 值-空白组的OD 值）× 100%，并应用Bliss 法计算半数抑制浓度（IC50）值。

1.2.3 细胞凋亡检测

（1）TUNEL染色

严格按照TUNEL 凋亡检测试剂盒操作说明书进行HeLa 细胞凋亡检测。取洁净无菌玻片置于24孔板底部，将对数生长期HeLa 细胞以密度为4 × 104个细胞/mL 接种于24 孔板。37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，待细胞贴壁后，实验组分别加入含不同浓度为10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素的 RPMI-1640 培养液 300 μL，对照组加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640培养液300 μL。每个剂量组均设6 个复孔。37℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h 后终止培养，取出玻片，4%多聚甲醛于4℃下固定 30 min，3% H2O2封闭 10 min，0.1%的 Triton-100 置于冰上打孔 5 min，加 80 μL 的 TUNEL检测液，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养2 h，DAPI 染核5 min，50%甘油封片。荧光显微镜下观察HeLa 细胞核荧光变化。结果判定：凋亡细胞核发出绿色荧光，未凋亡细胞核发出蓝色荧光。随机选取10个视野观察，分别计数凋亡细胞数和总细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

（2）Annexin V-FITC/PI双染法

严格按照AnnexinV-FITC/PI试剂盒操作说明书进行HeLa 细胞凋亡检测。分组及细胞培养同“（1）”。0.25%胰蛋白酶消化，1200 r·min-1离心5 min，收集细胞，PBS洗涤2次，250 μL结合缓冲液重悬细胞（Binding Buffer），2000 r·min-1离心 5 min 后，去除上清液，添加100 μL Binding Buffer 并吹打，依次加入 Annexin VFITC 和 PI 液各 5 μL 混匀，室温避光反应 15 min，再加入400 μL Binding Buffer，转移至流式管，于1 h 内流式细胞仪检测细胞凋亡，计算凋亡率。凋亡率（%）=Q2凋亡率+Q4凋亡率。

1.2.4 细胞粘附实验

将分组及细胞培养同“（1）”。预处理过的HeLa细胞接种于预先用Matrigel 胶包被96 孔板。37℃、5%CO2及饱和湿度培养120 min。PBS 洗涤2 次去除未粘附的细胞，加入MTT 20μL，37℃、5%CO2及饱和湿度培养4 h，加DMSO 150 μL 溶解结晶颗粒，置摇床上低速振荡10 min，酶标仪检测450 nm 处的OD 值，计算粘附率。粘附率（%）=实验组的OD/对照组的OD×100%。

1.2.5 划痕修复实验

将对数生长期HeLa 细胞以密度为4×104个细胞/mL接种于6孔板，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养，待细胞平铺面积达80%后，用已消毒的10 μL 枪头垂直划一条泳道，PBS 洗去脱落细胞。分组及细胞培养同“（1）”。倒置显微镜下拍照，用NIH image J 软件计算划痕面积，计算迁移率。迁移率（%）=实验组划痕面积/对照组划痕面积×100%。

1.2.6 Transwell小室体外侵袭实验

将Transwell 侵袭小室进行Matrigel 胶铺胶，置于恒温培养箱中进行固化处理。用无血清培养液将HeLa 细胞饥饿培养24 h 后，在上层小室加入200 μL密度为4 × 104个细胞/mL 细胞悬液，而在下室中加入完全培养基。分组及细胞培养同“（1）”。取出小室，弃上层小室培养液，PBS 洗涤3 次，无菌棉签擦去未侵袭细胞，结晶紫染色，倒置显微镜下计数穿过的细胞总数，计算侵袭率。侵袭率（%）=实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。

1.2.7 Western blot分析

分组及细胞培养同“（1）”。1200 r·min-1离心 5 min，收集细胞，充分裂解后提取总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度。在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺预制凝胶中，各培养孔加入50 μg 蛋白样品进行电泳。常规转膜后5%脱脂奶粉封闭2 h。分别与Ⅰ抗鼠抗人β-catenin 单克隆抗体，鼠抗人C-myc 单克隆抗体，鼠抗人Cyclin D1 4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，洗膜后加辣根过氧化酶标记山羊抗兔Ⅱ抗，37℃、5% CO2及饱和湿度下孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 显影。以GAPDH作为内参。Gel-pro 4.0软件进行分蛋白条带与GAPDH灰度比值，计算相对表达量。

图1 不同浓度冬凌草甲素对HeLa细胞增殖的影响

1.3 统计分析

采用SPSS 18.0 统计软件进行。数据分析计量资料采用“”表示，各组数据符合正态分布，方差齐时，采用单因素方差分析，组间两两比较，采用LDS 检验；方差不齐时采用 Games-Howell 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对HeLa细胞增殖的影响

HeLa细胞经不同浓度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素处理 12 h，24 h 和 36 h 后，以 CCK-8 检测细胞活力。结果显示，冬凌草甲素对HeLa 细胞增殖具有明显的抑制作用，且随着作用时间和作用浓度的增加，抑制作用逐渐增加（图1）。当冬凌草甲素浓度为 80 μmol·L-1处理24 h 时，HeLa 细胞活力约为 50%。24 h，48 h 和 72 h 的IC50分别为（151.36 ± 18.72）μmol·L-1，（62.10 ± 7.39）μmol·L-1和（8.41 ± 1.07）μmol·L-1。本研究后续实验采用 ≤80 μmol·L-（110、20、40 μmol·L-1）冬凌草甲素及24 h作为实验浓度和处理时间。

2.2 冬凌草甲素对HeLa细胞凋亡的影响

2.2.1 TUNEL染色结果

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa 细胞凋亡指数显著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图2、图3）。

2.2.2 Annexin V-FITC/PI双染法结果

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa 细胞凋亡率显著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图4、图5）。

2.3 冬凌草甲素对HeLa细胞粘附力的影响

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa细胞粘附率显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图6）。

2.4 冬凌草甲素对HeLa细胞迁移能力的影响

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa 细胞迁移率显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图7、图8）。

2.5 冬凌草甲素对HeLa细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa 细胞侵袭率显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图9、图10）。

2.6 冬凌草甲素对HeLa细胞侵Wnt/β-catenin信号通的影响

与对照组比较，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素组HeLa 细胞β-catenin、C-myc 和 Cyclin D1 蛋白表达均显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（图11、图12）。

3 讨论

本研究CCK-8 结果显示，冬凌草甲素可呈剂量-时间依赖效应的方式抑制HeLa 细胞增殖。同时本研究TUNEL 染色和Annexin V-FITC/PI 双染法结果显示，冬凌草甲素亦可诱导HeLa 细胞凋亡。以上研究结果与文献报道相一致[18]。

迁移和侵袭是恶性肿瘤转移和浸润的重要过程，迁移和侵袭能力越强说明肿瘤细胞运动能力越强，肿瘤越容易转移和浸润[19]。转移和浸润是一个受多种因素调控的复杂过程，除了与肿瘤细胞新生血管的形成有关以外，亦与细胞的粘附力，迁移和侵袭能力的改变有关，为恶性肿瘤治疗失败及预后较差的主要原因[20]。本研究通过细胞粘附实验检测了冬凌草甲素对HeLa细胞粘附力的影响，划痕修复实验检测了冬凌草甲素对HeLa细胞侵袭能力的影响，Transwell小室体外侵袭实验检测了冬凌草甲素对HeLa细胞侵袭能力的影响。结果显示，冬凌草甲素显著抑制HeLa 细胞粘附力，迁移和侵袭能力，且随着药物浓度增加，抑制作用逐渐增加。这些结果提示，冬凌草甲素除了可以抑制HeLa细胞增殖和诱导其凋亡以外，亦可通过抑制其迁移和侵袭能力共同发挥抗宫颈癌作用。

图2 TUNEL染色结果（×200）

图3 冬凌草甲素对HeLa细胞凋亡指数的影响

图4 Annexin V-FITC/PI双染法结果

图5 冬凌草甲素对HeLa细胞凋亡率的影响

图6 冬凌草甲素对HeLa细胞粘附率的影响

图7 划痕修复实验结果（×40）

图8 冬凌草甲素对HeLa细胞迁率的影响

图9 Transwell小室体外侵袭实验结果（结晶紫，×200）

图10 冬凌草甲素对HeLa细胞侵袭率的影响

宫颈癌细胞迁移和侵袭是制约其疗效、影响预后及的重要因素之一。恶性肿瘤细胞的转移和浸润是一个由多种分子参与调节的复杂过程。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内重要信号通路，与恶性肿瘤有着密切的关系，参与多个生物学进程调控（如调控细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等），其异常活化参与人类多种癌症的发病过程[21]。β-catenin 是 Wnt/β-catenin 信号通路关键的信号转导分子，是该信号通路激活的标志[22]。β-catenin表达量越高，肿瘤的恶性程度越高，迁移和侵袭能力越强，预后也越差[23]。当Wnt/β-catenin信号通路异常激活时，β-catenin 在细胞质中降解减少，去磷酸化并进入细胞核，进而开启下游C-myc 和Cyclin D1 等靶基因的异常表达，从而促进肿瘤细胞的增殖，转移和侵袭[24]。研究表明，宫颈癌患者及HeLa细胞β-catenin 表达异常[25,26]。本研究 western blot 分析结果显示，冬凌草甲素显著降低HeLa 细胞β-catenin、C-myc 和Cyclin D1 表达。以上结果提示，冬凌草甲素可抑制Wnt/β-catenin信号通路。

图11 Western blot结果

图12 冬凌草甲素对HeLa细胞Wnt/β-catenin信号通的影响

综上所述，冬凌草甲素具有抑制HeLa 细胞增殖的作用，亦可诱导凋亡及抑制迁移和侵袭能力，并抑制Wnt/β-catenin 信号通路。目前对于冬凌草甲素的抗宫颈癌作用仍不明确，今后的实验中还需要具体探讨。