陈春亮，匡长春，陈志龙，符旭东，刘辉 ，谢向阳

(1.中央警卫局保健处，北京 100017；2.中国人民解放军中部战区总医院药剂科，武汉 430070)

作为RNA药物中主要的一类药物，小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)凭借其独特的作用机制和确切的治疗效果，得到广泛的关注。目前美国食品药品管理局(FDA)已批准超过20个品种的siRNA药物进入临床实验阶段[1]。但siRNA在体内环境下不稳定，其相对分子质量较大，难以穿透细胞膜，进入靶细胞发挥治疗作用需借助适当载体才能实现。NGR(CYGGRGNG)作为一个主动靶向的配体，可以与CD13受体高表达的肿瘤细胞(如HT-1080细胞)特异性结合[2]。因此，可将NGR肽连接到siRNA载体的外表，利用NGR肽的主动寻靶特性，从而提高siRNA载体在肿瘤部位的浓度。本研究团队在前期实验基础上[3]，制备NGR修饰的声敏脂质体，然后对其进行理化评价，为RNA类药物的靶向递送提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 Optima超速低温离心机(美国Beckman公司)；RE52CS型旋转蒸发器(上海亚荣有限公司)；JY92-IID型细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；高压均质-挤出器(加拿大Avestin公司)；7500型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；Malvern纳米粒径仪(美国Malvern公司)； RF-5301型荧光分光光度计(日本岛津公司)；NanoWizarc原子力显微镜(德国JPK公司)； Autoflex III基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)(美国Bruker Daltonics公司)。

1.2药品与试剂 NGR肽(上海如吉生物科技有限公司，批号：20171108)；siRNA和FAM (6-fluorescein amidite)-siRNA(上海吉玛制药技术有限公司，批号：20160613)； DSPE-PEG2000-Mal [1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethy-lene glycol)-2000] (ammonium salt)]、DSPE-PEG2000 [1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethano-lamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000](美国Avanti公司，批号：203214，102261)；蛋黄卵磷脂(上海艾韦特医药科技有限公司，批号：B02315)；胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司，批号：501711)；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate， DEPC)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150813)；二氢卟吩e6(上海Sigma试剂公司，批号：C2061007)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20170118)。

2 方法与结果

2.1功能材料的制备 取NGR肽和DSPE-PEG2000-Mal(1：1，mol：mol)适量，置于含有三乙胺(5 eq)的二甲基甲酰胺溶液中，氮气保护下室温搅拌48 h，加入L-半胱氨酸(10 eq)反应4 h，封闭未反应的马来酰亚胺残基。对该反应液以双蒸水避光透析(截留分子量：35000)48 h，后经冷冻干燥处理，得到白色膨松物，密封存放于-20 ℃冰箱[4]。终产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization mass， MALDI-TOF MS)进行相对分子质量测定。脂材DSPE-PEG2000-MAL的马来酰亚胺基团(-MAL)与带有巯基(-SH)的半胱氨酸NGR多肽，可通过反应生成DSPE-PEG2000-NGR。合成的DSPE-PEG2000-NGR偶联物在MALDI-TOF MS的图谱，峰呈钟形分布，各细峰间相对分子质量相差44，推测为聚乙二醇(PEG)结构中重复单元结构[5]。由NGR(相对分子质量738)、DSPE-PEG2000-Mal(相对分子质量2941.6)计算可得DSPE-PEG2000-NGR相对分子质量为3678，这与终产物的MALDI-TOF MS(相对分子质量3 679.6)结果一致，由此表明功能材料合成成功。

2.2声敏脂质体的制备 参照文献[3]。采用薄膜分散-挤出法制备，在容量为300 mL烧瓶中，分别加入处方量的蛋黄卵磷脂、DSPE-PEG2000、胆固醇、DSPE-PEG2000-NGR、二氢卟吩e6(依次为：45，8，2，2，1 mg)，然后加入三氯甲烷-甲醇(2：1)(4 mL)溶解，45 ℃减压旋蒸40 min，挥去有机溶剂，待瓶壁上有透明薄膜形成后，加入2 μmol·mL-1的siRNA溶液8 mL(DEPC预处理5%葡萄糖水溶液)，继续旋蒸1.5 h(正常大气压)，水化液经高压均质挤出(孔径100 nm)10个循环后，得到半透明有蓝色乳光的siRNA/NGR-LP悬液。

2.3理化性质考察

2.3.1形态 采用透射电镜(transmission electron microscopy， TEM)和原子力显微镜(atomic force microscopy， AFM)观察siRNA/NGR-LP的外观形态，TEM方法：待测样品经5%葡萄糖水溶液适当稀释后，小心滴加在TEM专用的铜筛网上，滴加2%磷钨酸染色，吸水纸吸去多余液体，自然干燥后制成待测品。AFM方法：待测样品经去离子水适当稀释后，轻轻滴加在新去除表层的云母片上，室温干燥待测。结果见图1。由图1可见，制备的siRNA/NGR-LP多数粒子形态圆整，为球形或近球形。

图1 透射电镜(A)与原子力显微镜(B)观察siRNA/NGR-LP照片

Fig.1 Transmission election microscopy (A) and atomic force microscopy (B) photographs of siRNA/NGR-LP

2.3.2粒度分布和Zeta电位 采用激光粒度仪测定制备的siRNA/NGR-LP样品粒径和Zeta电位。激光粒度仪的设置为：发射波长633 nm，入射光与散射光间夹角90°，温度25 ℃ 。同时测定Zeta电位。结果见图2。由图可知，siRNA/NGR-LP的平均粒径为(101.56±9.82)nm。样品的多分散系数(PDI)为(0.101±0.007)，Zeta电位为(3.68±1.08)mV。

图2 siRNA/NGR-LP的粒径分布图

Fig.2 Particle size distribution of siRNA/NGR-LP

2.3.3包封率 先用pH值 8.0的TE缓冲液(由10 mmol·L-1Tris-HCl与1 mmol·L-1乙二胺四乙酸组成)配制成2～20 nmol·L-1的系列FAM-siRNA标准溶液，放入荧光分光光度仪(λex=490 nm、λem=515 nm)测定，以荧光强度(E)对浓度(C)进行线性拟合，得拟合方程为E= 29.113C+ 40.738，相关系数(R2)=0.999 7，表明在实验浓度范围内拟合方程的线性关系良好。

脂质体的包封率测定采用超速离心管法。将FAM-siRNA/NGR-LP样品液加到超滤离心管(截留分子量50 000)上层小室后，4 ℃ 、3000×g的条件下离心45 min，以离心管下层液体(未包封的FAM-siRNA)作为样品液，采用荧光分光光度法检测超滤离心样品液的荧光强度。将测定值代入上述拟合方程后，计算游离的FAM-siRNA浓度(C游)。

根据下式计算声敏脂质的FAM-siRNA包封率，包封率(%)= (C总-C游)/C总×100% ，C总为制备投料量。测得FAM-siRNA/NGR-LP的包封率为(74.52±2.49)%。

2.4稳定性考察 取制备的siRNA/NGR-LP样品50 μL，加入到磷酸盐缓冲液(pH值7.4)1 mL中，平行配制6份，混匀、密封、置于4 ℃冰箱中保存，于放置的当天(第1天)和第31天测定样品液的粒径和Zeta电位，考察样品在4 ℃条件下的稳定性。另以磷酸盐缓冲液(pH值7.4)和胎牛血清按1：9比例制成稀释液，将适量siRNA/NGR-LP样品稀释成样品液3 mL，置于Turbiscan Lab®Expert稳定性分析仪(37 ℃)中测定。

样品液放置第31天(4 ℃)，测定siRNA/NGR-LP的粒径为(108.04±3.14)nm，PDI为(0.102±0.072)，Zeta电位为(3.34±1.14) mV，各项指标与放置前相近，表明siRNA/NGR-LP在4 ℃ 的PBS(pH值7.4)中稳定性良好。稳定性分析仪的结果(图3)显示，48 h内样品的透射光和散射光波动均小于5%[6]，表明siRNA/NGR-LP在模拟血浆中未发生聚集或沉淀，所制备的声敏脂质体在48 h内稳定。

2.5体外释药行为考察 在透析袋中进行制备样品的声敏释药特性确证。量取FAM-siRNA/NGR-LP样品液2.0 mL至截留分子量为8 000的透析袋中(6份分成2组)，夹紧，置于释放介质(pH值7.4的磷酸盐缓冲液)100 mL中，然后置于37 ℃恒温水浴中振荡(75 r·min-1)，在0，1，2，4，6，8，12，24 h取样(其中一组在1 h时采用超声治疗仪(Intelect®2776， Chattanooge， USA)超声2 min(1 MHz、1 W/cm2)[5]，补加同体积的空白释放介质(37 ℃)，参照“2.3.3”项下测定FAM-siRNA浓度，计算累积FAM-siRNA释放率，绘制累积FAM-siRNA释放曲线。结果见图4。未经超声处理的FAM-siRNA/NGR-LP释药曲线呈突释和缓释两相：前4 h可认为处于突释阶段，在此段时间内FAM-siRNA释放近6%；此后药物释放减慢，24 h时累积释药不到10%。另一组FAM-siRNA/NGR-LP经超声波处理后，1 h内的FAM-siRNA累积释放量达86%。上述结果表明FAM-siRNA/NGR-LP的释药行为具有声敏的特点，在一定的超声条件下可迅速释放包载的大部分药物。

3 讨论

体外超声激发脂质体释放药物是将来脂质体在靶组织内释药的关键。本文采取的超声条件(频率、功率)沿用前期实验的结果[5]。选择的依据是在人体使用安全的超声条件下筛选激发条件。本研究的声敏脂质体激发原理主要是依靠超声激发声敏剂来实现，不同于常见的声敏微泡，其主要是依靠共振破膜释药。

在稳定性实验中，主要考察载体的低温下稳定性，只能为载体的实验室保存使用提供一定的参考依据。本文所制备的声敏脂质体在室温条件下大约可稳定8 d，其处方工艺有待进一步调整、优化，将其制成注射用冻干粉针可能较大幅幅度提高其稳定性。由于模拟血清成分的干扰较为严重，直接对siRNA/NGR-LP进行含量测定有一定困难，所以只采用稳定性分析仪对siRNA/NGR-LP的物理稳定性(胶体的光学性质)进行考察。

图3 稳定性分析仪的透射光和散射光图谱

图4 FAM-siRNA/NGR-LP的体外释药曲线

Fig.4Invitrorelease profiles of FAM-siRNA/NGR-LP

体外释放实验中发现，超声探头与透析袋贴合度的好坏，对药物的释放影响非常大，将来动物实验时需要仔细检查偶合剂在探头与皮肤间的填充情况。另外，超声波的频率、功率和刺激时间对声敏脂质体的释药行为都有一定的影响，其相互作用机理需要深入的研究。

从笔者前期有关NGR修饰脂质体的研究结果来看[2-3，5]，本研究制得的脂质体应当具有一定的肿瘤靶向性，具体需要后期活体成像实验或药动学实验进行确证。本文制备的siRNA/NGR-LP能否最终进入体内靶向部位发挥药效，需后继的动物实验才能确证。此外，载体应用的安全性方面问题亦待后继深入考察才能了解。总之，本文制备的NGR肽修饰的声敏脂质体给药系统对抗肿瘤药物靶向递送的研究具有一定的参考意义。