郑晓楠，王红宇，吕湘琳，王茜，齐红莉、通信作者，安立会

（1.天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.中国环境科学研究院，北京 100012）

富营养化以藻类过度生长为特征，已经成为从北美大湖到非洲维多利亚湖，淡水湖、池塘和水库中的一个全球环境问题[1]。其中，太湖是中国典型的富营养化湖泊，每年夏秋两季都会出现蓝藻的大量繁殖[2]。蓝细菌会释放各种毒素，例如微囊藻毒素（microcystins，MCs），其可在蓝藻生命周期中持续释放[3]，从而不断繁殖并富集在湖泊中，因此会对水生生态系统的稳定构成极大威胁[4]。

环境标志物是评价生态风险和环境健康风险的有效工具[5]，腹足类作为淡水生态系统的重要组成部分，是水生生态系统的主要消费者，其可被用作评估藻类毒素造成生态风险的环境指示生物[6]，对于维持特定的生态过程是必不可少的[7]。目前，国内外关于蓝藻毒素的研究主要集中于对鱼类生殖和子代发育的影响[8-10]，关于藻毒素对腹足类性腺发育的研究较少[6，11]。

纹沼螺（Parafossarulus striatulus）隶属于软体动物门（Mollusca），腹足纲（Gastropoda），豆螺科（Bithyniidae），沼螺属（Parafossarulus），是一种典型的淡水螺类，其广泛分布于中国和越南，大多栖身在湖泊和池塘中。本文研究了太湖水域4个位点纹沼螺在水华期和非水华期雌、雄生殖系统的外部形态和组织学特征，旨在探讨蓝藻水华期的纹沼螺生殖系统在外部形态和组织结构方面的变化，为研究蓝藻毒素对纹沼螺性腺畸变的机理提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 采集地

本次试验的样品主要采自太湖水域的4个采样点，分别为苏州湾（N31°05′～31°13′，E120°20′～120°29′），梅梁湾（N31°25′～31°35′，E120°07′～120°13′），竺山湾（N31°20′～31°30′，E119°54′～120°00′），贡湖（N31°20′～31°29′，E120°13′～120°25′）。

1.2 试验取材和方法

将采样的活体样品带回实验室，对纹沼螺进行地点分类。调查样品选用纹沼螺的成熟个体若干，用小铁锤将螺壳敲破，取出软体部分，沿腮下腺剪开外套膜，辨别雌雄性别[12]。样品用Bouin固定，对所取的个体组织采用常规石蜡切片法制作切片，经逐级脱水、透蜡、包埋、连续切片和HE染色，最后将纹沼螺生殖系统的组织切片在生物显微镜（Olympus CX21）下观察，并用数字扫描显微镜（Motic BA600）观察细胞清晰且颜色正常的切片，使用麦克奥迪数字切片扫描器系统1.0版本观察拍照，后期用Adobe Photoshop CC 2014对图像进行分析处理，性畸变个体的畸变程度根据Oehlmann等[13]的方法进行划分。

2 结果与分析

2.1 太湖水域蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的外部形态

通过观察纹沼螺外部的形态结构，发现前列腺、精巢、阴茎和输精管等器官构成了雄性纹沼螺的生殖系统，精巢一般呈黄色，生长在内脏团的顶端，紧贴肝脏，并随肝脏螺旋转动。前列腺一般呈棕黄色，与输精管相连，是精子从生精细管出发输送到集合管连接外套腔膨大的部位。输精管呈线性状突起，位于前列腺过外套膜边缘到阴茎基部。阴茎一般呈黑色或灰黑色，生长于足部右侧，基部较宽，在阴茎内部的输精管延伸部分具有多个阴茎导管（如图1A所示）。通过对比水华期和非水华期雄性纹沼螺阴茎的位置可发现，水华期纹沼螺为单阴茎且没有阴茎导管（如图1B所示），两者易区分。

图1 纹沼螺生殖系统的外部形态结构

雌性纹沼螺的生殖系统主要由卵巢、输卵管、纳精囊、卵囊腺、生殖孔等组织器官组成，其卵巢的形态结构与精巢相似，位于雄性纹沼螺精巢相应的位置。输卵管是从卵巢靠近壳轴侧发出的白色组织，纳精囊位于卵囊腺的左后方，卵囊腺沿外套腔右部出发，一般呈透明状，生殖孔的位置临近肛门处（如图1C所示）。非水华期雌性纹沼螺与水华期纹沼螺外部形态上差别不明显（如图1D所示）。

2.2 太湖水域4个采样点蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织结构

2.2.1 苏州湾（SZ）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织结构

通过观察苏州湾蓝藻非水华期雄性纹沼螺的组织学切片，发现精巢接近半月型，细胞结构明显（如图2A所示）。基膜间精原细胞近椭圆形，细胞核卵圆形，核大，核内零散分布一些嗜碱性被染成蓝紫色的颗粒，数量较多且排列规则。初级精母细胞经精原细胞分裂而成，细胞近圆形，大量分布在管腔内，胞膜不明显，核较大，染色质着色较深。精细胞近圆形，经次级精母细胞第二次成熟分裂形成，较精母细胞略小，数量较精母细胞减少，核经苏木素染色后最深。输精小管内精子呈杆状，成熟的精子尾端似鞭毛，可被染成蓝紫色且排布均匀。在其精巢中各阶段的生殖细胞数量与水华期雄性纹沼螺比较相对较多，且生殖细胞排列规律（如图2B所示）。

图2 苏州湾（SZ）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织学结构（H&E）

由苏州湾蓝藻水华期雄性纹沼螺切片可观察到精巢内生殖细胞的结构不清晰（如图2C所示）。图2D显示，分布在基膜间的精原细胞间隙较大，对比非水华期雄性纹沼螺的数量明显降低。初级精母细胞零散的分布在管腔中，个体较小且在数量上极显著减少。精细胞散落在细胞质中，个体不大且数量变少。精子的形状和大小与非水华期雄性纹沼螺对比无明显差异，但在数量上有所减少。精巢中各阶段生殖细胞与非水华期雄性纹沼螺相比，排列不规律、个体均偏小、数量均偏少。

由苏州湾蓝藻水华期雌性纹沼螺切片可观察到整个卵巢的最外层由结缔组织包裹，可观察到其细胞结构（如图2E所示）。蓝藻非水华期雌性纹沼螺的生殖细胞结构均清晰可见且分布均匀，与水华期在结构上没有明显差别（如图2F所示），卵巢丰满，可见卵泡呈空白圆形且均匀分布在间质中。卵原细胞分布在滤泡壁的基底膜上，呈圆形，核大，细胞质着色较深。成熟卵母细胞的形状由于细胞间相互挤压而不规则，核大且偏离细胞中央，细胞质着色浅，核膜清晰可见。各阶段性腺细胞大小正常，分布整齐。

2.2.2 梅梁湾（ML）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织结构

通过梅梁湾蓝藻水华期雄性纹沼螺切片可观察到，其各阶段生殖细胞的形态与苏州湾水华期雄性纹沼螺生殖细胞极相似，且数量比例也大体一致。在输精小管内可见零散的精子，成熟的精子头部被深度染色（如图3B所示）。

图3 梅梁湾（ML）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织学结构（H&E）

如图3C所示，与梅梁湾蓝藻水华期雄性纹沼螺的精巢组织切片相比，梅梁湾蓝藻非水华期纹沼螺精巢中各阶段生殖细胞不仅在数量上有明显的优势，且在细胞形态上也较其清晰，精巢内细胞规律分布（如图3D所示）。

通过梅梁湾蓝藻非水华期雌性纹沼螺的切片可观察到，卵巢被疏松的结缔组织包裹，其各阶段生殖细胞的结构明显。卵原细胞呈卵圆形，核大。卵母细胞的细胞质嗜酸性，被H.E染红；细胞核嗜碱性，被染成蓝紫色（如图3F所示）。梅梁湾蓝藻水华期雌性纹沼螺的切片中可清晰地观察到卵泡、卵原细胞、卵母细胞等生殖细胞的结构（如图3E所示），因此两者无明显差别。

2.2.3 竺山湾（ZS）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织结构

通过观察竺山湾蓝藻水华期雄性纹沼螺切片可发现，精巢呈团状，最外层为单层立方上皮。如图4B所示，精原细胞轮廓清晰，核大呈卵圆形，精原细胞和精母细胞的形态差异较大，易区分。精母细胞的数量较少，精细胞和精子的数量较非水华期也有所减少，输精小管内的成熟精子头部被染成蓝紫色，尾巴似鞭毛且排列无规律。

图4 竺山湾（ZS）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织学结构（H&E）

从竺山湾蓝藻非水华期雄性纹沼螺的切片中可发现，精巢的结构较水华期更完整、清晰（如图4C所示），精巢中各阶段生殖细胞的数量也比水华期雄性纹沼螺数量多，且排列规则（如图4D所示）。

从图4E中可发现，竺山湾蓝藻水华期雌性纹沼螺中的卵母细胞个体差别较大，细胞质嗜酸性，经H.E染成红色，细胞核被染成蓝紫色，核仁较大。卵原细胞呈圆形，分布在滤泡壁的基底膜上。竺山湾蓝藻非水华期雌性纹沼螺的卵巢被结缔组织包裹，各阶段性腺细胞的大小正常，分布整齐，卵泡、卵原细胞、卵母细胞等排列均匀且清晰可见（如图4F所示）。

2.2.4 贡湖（GH）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织结构

通过贡湖蓝藻水华期雄性纹沼螺的切片可观察到，基膜间精原细胞近椭圆形，其胞内含有小颗粒，同细胞核均被染成蓝紫色，核仁着色较深。精母细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，嗜碱性，经苏木素染成蓝紫色。精细胞较精母细胞的个体略小，但两者数量极少。精子分布均匀，数量少（如图5B所示）。

图5 贡湖（GH）蓝藻水华期与非水华期纹沼螺的性腺组织学结构（H&E）

通过贡湖蓝藻非水华期雄性纹沼螺的切片可发现，其精巢内生殖细胞的结构均饱满且染色清晰，细胞分布规律。蓝藻水华期雄性纹沼螺各阶段生殖细胞的数量次之，且个体较小（如图 5D所示）。

从贡湖蓝藻水华期雌性纹沼螺切片中可观察到，整个卵巢丰满，被包裹在疏松的结缔组织中，卵原细胞呈椭圆形，胞内小颗粒被染成蓝紫色，核大且圆。各阶段生殖细胞的结构染色均清晰（如图5E所示）。从贡湖蓝藻水华期雌性纹沼螺的切片中可清晰地观察到卵泡、卵原细胞、卵母细胞等生殖细胞的结构（如图5F所示），因此两者无明显差别。

3 讨论

3.1 太湖蓝藻水华期对纹沼螺外部形态结构和性腺组织结构的影响

本试验通过观察太湖水域4个采样点纹沼螺的外部形态及性腺组织切片发现，蓝藻水华期释放出的蓝藻毒素不仅会导致雄性纹沼螺的阴茎导管缺失，而且其精原细胞、精母细胞、精细胞和精子数量的减少都呈现出畸变的现象。此现象可能是因为湖泊水体富营养化导致蓝藻大量繁殖，造成蓝藻水华周期性爆发，蓝藻会释放各种毒素，从而不断繁殖并富集在湖泊中[14]。蓝藻毒素是内分泌干扰素的一种，可产生维甲酸[15]，维甲酸对动物有很强的致畸作用。因此，当毒素被摄入到生物体体内时，不仅会影响生物的正常生理活动，还会导致生物发生畸变等异常现象[16]。本试验结果与杨涛等[17]关于微囊藻毒素对水生动物生殖系统影响的研究结果基本一致，当微囊藻毒素被摄入到水生动物体内后，水生动物会出现生长缓慢等不同程度的不良影响，严重的可直接影响生物性腺发育情况、降低其后代的个体质量。本文发现，太湖蓝藻水华期较非水华期雌性纹沼螺外部形态和性腺组织差别不明显，与王雅琴等[18]的研究结果基本一致，多种环境雌激素长期暴露可有效降低斑马鱼精子的数量，而其对雌性斑马鱼的性腺发育没有影响。环境雌激素具有强烈的雌激素效应[18]，环境释放出来的剂量可阻碍无脊椎动物的生长发育，诱导鱼类、蛙类等发生“雌化”[19-21]。因此，关于太湖蓝藻水华期对纹沼螺外部其他组织结构的变化和性腺组织发育的影响机制仍需进一步研究。

3.2 太湖水域4个采样点纹沼螺性腺组织畸变程度的比较

通过观察太湖水域4个采样点水华期与非水华期纹沼螺性腺的组织学结构，发现蓝藻水华期雄性纹沼螺精原细胞、精母细胞、精细胞和精子的数量较非水华期均有不同程度的减少趋势。在蓝藻水华期，苏州湾和梅梁湾2个采样点的雄性纹沼螺的性畸变程度差别不明显，但高于竺山湾，性畸变程度最低的是贡湖。这与成厚城[22]进行的微囊藻毒素-LR对斑马鱼生殖和子代发育影响的研究结果一致。研究发现，微囊藻毒素水平的升高可导致斑马鱼性腺畸变率升高，其产卵量呈显著下降的趋势。Muenpo[23]研究了 5种不同浓度的TBT诱导方斑东方螺（Babylonia areolata）配子的发生，发现其可诱导雌性方斑东方螺发生不同程度的性畸变现象。本试验太湖4个位点水华期雄性纹沼螺的性畸变程度不同可能与4个采样点的藻毒素浓度有关，关于藻毒素种类及浓度对纹沼螺性腺畸变机制的研究仍需进一步探讨。

4 结论

本试验通过组织解剖学和常规石蜡切片的方法，研究了太湖水域4个位点纹沼螺在蓝藻水华期生殖系统的外部形态和组织结构方面的变化，为藻毒素对淡水螺类性腺畸变的机理研究提供组织学方面的基础数据，对进一步丰富生态毒理学具有重大意义。同时由于采样时间的局限性并未观察到生殖细胞在功能上发生的异常，也未深入剖析是否具有遗传毒性，蓝藻毒素等污染物在纹沼螺体内的作用机理还有待进一步研究和探索。