丁英庆+付煜鑫+徐波+薛树平+张炯+刘萍

摘要：为研究自然条件下溶藻菌RZ14菌株治理水华的效果，在调查泉城公园景观水体富营养化状况的基础上，选取水华较严重的映日湖作为该溶藻菌剂原位生物控制的测试水域，对该湖区叶绿素a、有机质、氨氮及总磷变化进行跟踪测定。结果表明，映日湖水华现象严重，未达到一般景观用水V类标准，属重度营养化。经该溶藻菌剂生物治理后，水华消除，叶绿素a含量低于0.05 mg/L，CODCr清除率50.01%，BOD5清除率73.38%，氨氮清除率70.51%，总磷清除能力88.59%。通过原位试验，表明RZ14抑藻剂能快速消除水华现象，对富营养化水体治理效果显著，可开发为溶藻菌剂应用于蓝藻水华的治理。

关键词：水华；富营养化；溶藻菌；生物修复

中图分类号：X524 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5214-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.013

Abstract： For study of the algicidal bacterium RZ14 stains control effect under natural conditions of water blooms，Yingri pool where blooms had happened seriously were carried on in-situ bioremediation based on the investigation of eutrophication on Quancheng park landscape water body. And chlorophyll a content，organic matter content，ammonia nitrogen content and total phosphorus content were measured before and after bioremediation. The results showed that the bloom phenomenon was serious in Yingri pool. Water quality were not up to the general landscape water standard（class V），belonging to hyper eutropher. After biological agent treatment，blooms disappeared，chlorophyll a content was lower than 0.05 mg/L，CODCr removal rate was 50.01%，BOD5 removal rate reached 73.38%，NH4+-N removal rate reached 70.51%，and total phosphorus removal rate reached 88.59%. In-situ experiments showed that RZ14 algal inhibiter agent could quickly eliminate water blooms. And it had a notable effect on eutrophic water body. Algicidal bacterium RZ14 might be developed algicide to control cyanobacteria blooms.

Key words： blooms； eutrophication； algicidal bacterium； bioremediationt

水體富营养化是引起水华蓝藻暴发的主要原因，不仅造成生态环境的恶化，蓝藻产生的毒素对鱼类、哺乳动物乃至人类健康造成极大威胁，尤其是景观水体发生水华后，对旅游产业也会造成重大经济损失[1-3]。目前，水体富营养化治理措施主要包括物理、化学和生物法[4，5]。物理和化学法对富营养化水体的控制技术相对比较成熟，但对于开放性湖泊、河流的控制还存在很大的局限性，尤其是化学方法造成的二次污染对生态环境带来极大的破坏。而生物控制技术在这方面表现了其优越性，植物浮床去除水体氮、磷等元素效果显著，而利用微生物措施对环境进行治理，更受到国内外环境工作者的普遍关注。尤其是具有溶藻活性的微生物对环境友好，二次污染较低，能高效控制水华和赤潮藻种[6-10]。但溶藻菌是否可以吸附、转化、吸收和降解水体的有机物质、N、P等元素，达到治理水体富营养化的目的，还需进一步研究。

前期研究发现，拟采用的溶藻菌RZ14菌株菌体细胞溶藻效果不显著，但其培养液对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）具有完全溶藻抑藻活性。故将该菌发酵后制成抑藻剂，以济南泉城公园景观湖泊作为测试点，研究了该菌株在自然环境下对富营养化水体的控制效果。济南泉城公园有两大景观水系，采用生物污水处理后的中水作为水源，其水源含有较高浓度的N源及P源，加上其他污染因素，导致各景观水系水体质量显著下降。近几年各湖区水华频繁暴发，甚至部分水域散发恶臭气味，景观水体生态功能遭到严重破坏。本研究在调查泉城公园各湖区水体状况的基础上，选取映日湖作为测试湖区，采用原位生物治理措施，研究了RZ14菌株对富营养化水体中的藻类、氮、磷及有机质的去除效果，其研究结果为溶藻菌剂修复富营养化湖泊提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种分离纯化与培养

采集水样后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基进行摇床培养，培养温度28 ℃，转速150 r/min。发酵48 h后，以体积比1∶10，接入处于对数生长期的铜绿微囊藻培养瓶中进行共培养，铜绿微囊藻藻种购于中国科学院武汉水生生态研究所，藻种编号905，属高产毒藻种。培养温度26 ℃，光照800 lx，光暗周期12 h/12 h。观察藻液黄化状况，从发生黄化的藻液中分离目的菌种。利用涂布平板法获得初试菌株，反复进行溶藻测试后，选择溶藻效果较好溶藻菌株RZ14进行液体发酵罐发酵。发酵72 h后的细菌菌液作为菌剂来源。

1.2 RZ14菌株细胞形态观察及溶藻性能测试

将RZ14菌株接种于LB固体平板培养基进行培养，培养16 h后，对菌体细胞进行经典革兰氏染色，利用FR-988生物显微图像分析系统对菌体进行观察，并测定细胞大小。

溶藻测试取发酵72 h的菌体培养液离心，滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤，镜检无菌后，取5 mL无菌滤液接种于对数生长期的铜绿微囊藻培养瓶，藻液体积50 mL。对照添加相同体积的无菌液体培养基，每个处理设3个重复。藻液初始吸光度为OD687=0.354，初始叶绿素含量1.061 8±0.036 7 mg/L，培养条件26 ℃，光照800 lx，光暗周期12 h/12 h。在663、645、630、750 nm波长下测定吸光度，按照以下公式计算叶绿素a含量，同时对藻体进行显微观察。

叶绿素a（mg/L）=11.64×（OD663-OD750）-2.16×（OD645-OD750）+0.1×（OD630-OD750）

1.3 菌剂投加方式

试验自6月10日始投加RZ14菌剂，连续投加6 d，并进行曝气。7月2日，继续投加该菌剂，每隔5 d投加一次，连续投加3次。投放浓度为10 mg/L。水体采样标志用浮标法，每次采集5点，根据外观变化进行取样检测。

1.4 水体测定项目及评价方法

CODMn采用高锰酸钾指数法测定；CODCr采用重铬酸钾法测定；BOD5采用稀释接种法测定；TN采用过硫酸钾-紫外分光光度法测定；氨氮采用纳氏试剂光度法测定；TP采用钼锑抗分光光度法测定；叶绿素a（Chla）采用分光光度法测定；透明度（SD）采用塞氏盘测定；DO采用溶解氧仪测定。测试数据采用SPSS 10.0软件进行方差分析。

映日湖面積约7 700 m2，平均水深1 m，沿岸种植水生植物，水面建设有浮岛，属于沉淀的封闭类型。水源来自公园西南角与东北角的三站和四站，其中三站污水处理工艺采用ETS生态处理系统，四站采用一级强化滤料处理工艺。水质监测结果中，选取5个主要的指标（CODMn、叶绿素Chla、总磷TP、总氮TN、SD）参与富营养化的评价，采用综合营养状态指数法对湖区水质现状调查结果进行评价。

2 结果与分析

2.1 RZ14菌株细胞形态观察

RZ14菌株显微观察如图1所示。RZ14菌株细胞呈杆状，细胞大小为0.533～0.947 μm×1.593～2.024 μm，革兰氏染色阳性，芽孢中生。

2.2 RZ14菌液对铜绿微囊藻细胞生长的影响

在共培养3 d后，RZ14处理组叶绿素含量开始下降，但此时藻液并未出现黄化。至培养5 d时，该处理组藻液发生黄化现象；培养7 d，藻液完全变白，底部有白色沉淀物，此时叶绿素含量降至1.009 6 mg/L，而对照组叶绿素含量持续增高至1.569 5 mg/L；共培养23 d，RZ14处理组叶绿素含量仍持续下降，其含量为0.249 5 mg/L（图2）。在共培养8 d时，对各处理组藻细胞进行显微镜检，用改良苯酚品红溶液染色20 min，显微观察结果见图3。CK组铜绿微囊藻细胞仍以集群方式生存，而RZ14菌液处理组藻细胞发生解体，未观察到完整的藻细胞，图3B可清楚观察到藻细胞膜残体。室内测试结果显示，该菌株能明显导致铜绿微囊藻细胞的裂解。

2.3 映日湖水质分析及营养状况评价

映日湖水体多年发生水华，湖区表面漂浮绿色的浮萍，部分区域散发恶臭气味。水质分析（表1）显示，除TP含量略低（<0.5 mg/L）外，叶绿素、有机质、总氮含量都较高，水体透明度不足20 cm，水体质量未达到《地面水环境质量标准》（GB3838-83）V类水质标准，即达一般景观水体标准。映日湖水源本身是生活污水处理后的水，由于其处理工艺的限制，氮磷含量相对较高，再加上雨水、生活污水、冲刷路面污水等外源污染物流入，综合营养指数法评价结果显示为重度富营养，污染极其严重。

2.4 RZ14菌剂使用后水质变化状况

2.4.1 抑藻剂对两湖水体CODCr的影响 投放抑藻剂后，映日湖水体化学需氧量降低较明显，后期略有提高，与36 d测定结果差异并不明显（图4）。在处理5 d时，化学需氧量有明显的降低，与未处理测定结果有显著差异，随后持续下降，在处理36 d时降至最低。在处理后54 d，化学需氧量的清除率为50.01%。

2.4.2 抑藻剂对水体BOD5的影响 抑藻剂对映日湖水体BOD5去除效果非常显著，54 d清除率达73.38%（图5）。在菌剂投放初期，水体中生化需氧量有轻微波动，较处理前略有提高，但与处理前差异不明显，这可能是溶藻菌剂本身造成的，也可能是由于藻细胞裂解后，向水体释放有机物质造成生化需氧量有所提高。处理36 d生化需氧量基本降至最低，处理54 d时，含量虽略有下降，但与36 d测定结果未达显著差异。

2.4.3 抑藻剂对水体氨氮及总磷的影响 投放抑藻剂后，映日湖氨氮含量、总磷含量都有不同程度的降低（图6、图7）。从图中可见，在处理初期，水体氨氮及总磷含量皆无明显变化，在处理36 d时，氨氮及总磷含量明显下降，随后，氨氮含量略有提高，但是总磷含量持续降至最低，至处理54 d时，氨氮及总磷清除率分别达70.51%和88.59%。

2.4.4 抑藻剂对水体叶绿素a的影响 映日湖水华暴发已多年，投放该菌剂后，蓝藻水华明显得到控制，水体叶绿素a含量大幅度下降，在处理10 d时，叶绿素a含量即有明显降低；至处理22 d时，水体叶绿素a含量降至0.054 mg/L，随着处理时间延长，叶绿素a含量仍有下降，但变化不显著，至处理47 d时，叶绿素含量降至0.045 mg/L（图8）。叶绿素浓度可直接指示水体藻类的生物量，可见抑藻剂能明显抑制蓝藻生长，消除蓝藻水华。

3 小结与讨论

泉城公园映日湖水体处于重度营养化状态，经过RZ14菌剂治理后，影响水体最严重的水华现象得到有效控制，水面蓝藻消失，叶绿素a含量大幅度下降，CODCr清除率达50.01%，BOD5清除率达73.38%，氨氮清除率达70.51%，总磷清除率达88.59%。可见，RZ14菌株能有效去除水华现象，对富营养化水体治理效果明显。

自然水体中，蓝藻与异养生物细菌之间有着密切的关系，这种关系表现在共生、拮抗或中性[11]，已发现某些细菌能分泌藻类生长促进剂，如植物激素吲哚乙酸（IAA）[12]，而某些细菌可释放除藻剂，目前研究工作主要集中在对有害蓝藻的控制方面[13，14]。张将[15]研究了一株溶藻菌株S4的菌剂生产工艺，认为该溶藻细菌发酵液可以直接投入发生水华的水体，也可以辅以一定载体。其烘干后的粉状溶藻菌剂在1∶2 000的投加比例下，4 d后溶藻效率可达86.41%。本研究在自然水域的溶藻效果研究中也得到了类似结果。在投放菌剂3 d后，即观察到湖面水华蓝藻出现集聚现象，分布面积逐渐减少，7 d后基本消除，湖水呈绿色。叶绿素分析结果也显示，在处理10 d时，叶绿素含量明显下降，与处理前比较呈显著差异。可见利用溶藻菌开发生物菌剂具有广泛的前景。伊扬磊[16]研究了一株不动杆菌属溶藻菌对铜绿微囊藻毒素分泌的影响，96 h后藻体细胞胞内毒素减少了51.4%，胞外毒素减少了53.0%。本研究仅对水华蓝藻生长及菌剂投放后水体有机物质、氨氮及总磷等进行了分析测定，未涉及蓝藻细胞藻毒素的释放及变化情况，虽然近两年跟踪观察结果显示，映日湖水体生态功能恢复，生物多样性增加，但该溶藻菌的生态安全性问题仍有待深入探讨。

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