王李瑶，孙 龙，毛加荣，霍黎生

陕西省中医医院（西安710003）

近年来随着经济的发展，人们工作方式，饮食结构的变化，功能性便秘（Functional constipation，FC）的发病率越来越高，FC是指由非器质性原因引起的无法排便或排便困难相关的腹部病症，并通过排粪造影，结肠镜，肠道钡剂灌肠或甲状腺功能检测等相关影像学或实验室检查，排除其他原因造成的继发出现的便秘症侯群［1］。结合肛门直肠动力和感觉功能的特点将FC大致分为以下三类［2］：①慢传输型便秘（Slow transit constipation，STC），②出口梗阻型便秘（Outlet obstructive constipation，OOC），③ 混 合 型 便 秘（Mixed constipation，MC ）。其中，出口梗阻型便秘（OOC）是指盆底组织、器官的结构、功能发生改变，导致排便困难或羁留性便秘综合征，慢性便秘一种，发病率高，女性高于男性［3］。直肠前突、直肠黏膜脱垂、直肠内套叠是主要病因［4］。

直肠黏膜脱垂又称直肠内套叠，是指直肠黏膜与肌层间结缔组织过于松弛，黏膜层下移，是引起出口梗阻型便秘的原因之一，为直肠本身的一种退行性改变［5］。我们的研究将集中于以直肠黏膜脱垂为主要病因的OOC病例。Cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal，ICCs）是西班牙神经解剖学家 Cajal于1893年观察到的一种非神经但又与神经密切相关的特殊细胞，是胃肠道慢波的起搏细胞（Pacemaker cells），并参与慢波的传播，对肠神经系统神经信息传递具有重要的调控作用［6］。在光镜下，ICCs呈纺锤状或星状，核大，几乎所有的ICCs都表达CD117，通过免疫组织化学技术对CD117进行标记，可在光镜水平观察ICCs形态和分布特点［7］。Hagger等发现巨结肠标本纵行肌，环形肌，平滑肌间ICCs密度明显下降［8］，Adachi［9］等对4列乙状结肠巨结肠患者肠标本进行研究，结果发现神经肌肉结构未见明显组织学改变，但是表达CD117的ICCs是减少的，因此指出：CD117阳性ICCs表达下调可能是导致巨结肠的重要因素。关于ICCs在OOC方面的研究报道极少，而ICCs在OOC病患病灶处的结构形态分布特点还未见报道。

本实验利用通过免疫组织化学染色标记CD117，观察以直肠黏膜脱垂为主要病因的梗阻性便秘（OOC）患者相对于混合痔患者直肠肌壁的黏膜层、黏膜下层和肌层中Cajal间质细胞的异常变化，从而推断肠神经系统在OOC中的调控作用。

材料与仪器

1 主要试剂 一抗：CD117免疫组化试剂 （中杉金桥），通用型二抗（安必平），DAB显色试剂盒（迈新生物），0.1mol／L柠檬酸盐缓冲液（迈新生物），100%、95%、80%乙醇（天津瑞金），二甲苯（天津瑞金），苏木素染液（贝索），中性树胶（上海懿洋）。

2 仪器与设备 电子显微镜（奥林巴斯公司），图像采集系统（奥林巴斯公司），超声波清洗器KQ3200DA（昆山苏美），FA1004A分析天平（上海精天电子仪器有限公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司），－20～4℃低温冰箱（Hair公司），18cm不锈钢高压锅（沈阳压力国厂），数字显示移液器（芬兰GILSON公司），黏附载玻片（福州迈新）。

3 标本的获取 依据纳入和排除标准，对符合条件的患者查随机数字表法选取72例，产生随机序列。信封法对纳入的患者查随机数字表法分为OOC组（36例）、对照组（36例）。采取手术方式为改良TST切除术，切取OOC组及对照组患者经排粪造影证实有直肠黏膜脱垂段直肠肠壁，术中肠管标本取下后切取全层肌壁组织。

4 标本处理 标本取下后经PBS缓冲液冲洗后置于4%多聚甲醛中固定24h后经修整取材，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋后制成石蜡标本，应用轮转式切片机切片，温水漂浮法捞片，烤干备用。

5 苏木素及伊红染色 将切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中进行醇化后入苏木素染液中10min，伊红染液3min后脱水、透明与封片。

6 免疫组化染色 将切片依次放入二甲笨透明及梯度乙醇溶液中进行醇化后高压蒸汽修复10min，3%甲醇双氧水阻断后滴加一抗（CD117）及二抗，然后经DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水等步骤最后透明封片。

7 显微镜下观察计数 应用光学显微镜观察，以结构清晰，着色明显高于背景，在相应部位胞膜和胞浆着色，出现黄色或棕黄色颗粒的细胞为阳性，无着色或着色强度与背景无差异为阴性，同一切片中随机取10个高倍镜视野（10×40倍）并计数黏膜固有层、黏膜下层及肌层中不同部位中CD117阳性细胞数量并观察细胞的形态改变。然后在电脑中使用IPP6.0软件进行细胞计数及灰度值分析。

8 统计学方法 选用SPSS19.0统计学软件进行分析，实验数据以（±s）表示，检验方法为两样本独立t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

结 果

显微镜下观察到，与对照组相比较，OOC组患者直肠肠壁中肌层和黏膜下层中的CD117阳性表达细胞是明显减少。正常Cajal间质细胞形态应为纺锤状或星状，而本研究OOC组中，细胞染色较正常变弱，形态变圆钝，形成的神经网络变少，而在黏膜固有层中的CD117阳性的表达的细胞几乎不变甚至是增加的，细胞形态也没有明显变化（图1）。人工计数和免疫组化分析软件观察CD117在患者黏膜层和黏膜下层中的表达的定量结果，见表1、2。

表1 CD117阳性细胞在OOC患者直肠肠壁中不同区域的计数比较（±s，个）

表1 CD117阳性细胞在OOC患者直肠肠壁中不同区域的计数比较（±s，个）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05

分 组 黏膜固有层 黏膜下层 肌层OOC组 16.02±0.61 28.78±0.62△ 10.44±0.66△对照组 7.55±0.69 40.96±0.63 15.24±0.68

表2 CD117阳性细胞在OOC患者直肠肠壁中不同区域的IOD值差异比较（±s，个）

表2 CD117阳性细胞在OOC患者直肠肠壁中不同区域的IOD值差异比较（±s，个）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05

分 组 黏膜固有层 黏膜下层 肌层OOC组 32.02±0.53 8.78±0.63△ 5.25±0.87△对照组 27.55±0.89 17.96±0.78 12.44±0.56

图1 CD117阳性细胞在OOC患者直肠肠壁中不同区域的表达差异

讨 论

目前，关于OOC的相关发病机制还都探索中，其中之一就是关于肛门直肠动力改变及感觉功能障碍等学说［10］，某些神经性疾病可引起相应神经支配肌肉的不协调性收缩。正常排便过程依赖于高度协调的感受和运动机制，其涉及自主神经系统，肠神经系统和依赖躯体神经的相互作用与盆底肌肉活动的顺序变化，该途径的任何部分的损害都将导致某种形式的便秘［11］。随着神经肠胃病学的发展，将在神经、细胞和分支层次进一步阐明控制肠道功能之间的相互关系［12］。例如Bassotti等研究发现，OCC患者黏膜下神经丛中的神经元明显减少，在肌间神经丛中数量正常，神经胶质细胞在两种神经丛中都减少［13］。又如崔华勤等通过对885例病人检测的结果发现，53例耻骨肌肥厚症的病人，48例肌电图表现明显异常，31例盆底痉挛综合征病人中，29例表现明显异常［14］。通过以上研究我们初步推断，OOC的病因与直肠肌壁的神经电生理改变密切相关，而引起这种动力异常的深部原因尚不明确，ICCs以网络状分布在胃肠道，分为黏膜下ICC、肌间ICC、肌内ICC、深层肌丛ICC这四种，结肠肌间神经丛周围的ICCs数目高于环、丛肌层。ICCs是胃肠道慢波的发起者，它可以产生慢波并通过网络结构及平滑肌之间的连接将慢波传出，从而引起胃肠道的平滑肌的收缩，ICCs细胞膜上存在多种神经递质受体，可作为神经冲动传出与平滑肌之间的中介。结肠的ICCs具有控制结肠运动自主节律性的功能，ICC减少，特别是CC－SM和SS－SM的明显减少，影响肠慢波的产生和传播，扰乱肠道神经系统与平滑肌间的信息传递，导致结肠运动功能紊乱，通过时间延长，出现临床症状［15］。

我们实验组尝试从肠神经系统的变化中寻找原因。Cajal间质细胞是肠神经系统特殊类型的间质细胞，大量研究表明，它是胃肠道慢波的起搏细胞（Pacemaker cells）并参与慢波的传播，对肠神经系统神经信息传递具有重要的调控作用［16］。近年来，ICCs与胃肠动力紊乱所导致的疾病之间的关系也越来越得到了实验支持，目前关于功能性便秘，国内外已有不少相关研究，多数应用Cajal间质细胞特异性标志物CD117来进行研究。例如包云光等发现，在慢性传输性便秘患者中，远端结肠黏膜的CD117的数量少于对照组［17］。Torihashi等对30余例慢性特发性假性肠梗阻患者的肠壁组织进行的研究指出：其中有三分之一的患者CD117阳性的ICC缺失或大量减少，从而推测ICCs的正确移行和分化障碍可能导致慢性特发性假性肠梗阻［18］。

在我们的研究中，通化利用免疫组合标记Cajal间质细胞特异标记物CD117后，分析结果显示，在OOC患者的结肠黏膜下层中CDⅡ7阳性的细胞表达计数平均值为（28.78±0.62），肌层中CD117表达阳性细胞的计数平均值为（10.44±0.66），而在相应对照组，结肠黏膜下层中CDII7阳性的细胞表达计数平均值为（40.96±0.63），肌层中 CD117表达阳性细胞的计数平均值为（15.24±0.68），相应的IOD平均值也都有类似的改变。总的来说，OOC组的ICCs细胞是明显低于对照组的，并且可见直肠黏膜下层及肌层中肠壁中的ICCs体积变小，形成的神经网络结构变少。而王亮等发现在先天性巨结肠患儿狭窄段肠壁各层ICCs密度明显减少或消失，正常网络结构遭到破坏［19］。童卫东等发现慢性传输性便秘患者肌壁个区域CD117的表达均下降［20］。ICCs在胃肠道不同层面几乎都有分布，且功能也略有不同，比如肌间神经层ICCs是胃肠道的主要起博细胞，而黏膜下层的ICCs是结肠的主要起博细胞［21］。在我们的实验中也发现，无论是OOC组还是对照阻，患者的黏膜固有层中，ICCs的数量几乎没有变化甚至略有升高，这可能与ICCs在肠壁中不同部位的分布不同有关。结合各项实验结果可以看出，ICCs数量的减少及功能缺失与多种胃肠道功能障碍性疾病高度相关。

正常情况下直肠膨胀刺激肠壁和耻骨直肠肌压力感受器，引起内、外括约肌及耻骨直肠肌松弛，肛直角变大，开始排便活动［22］。出口梗阻性便秘的发病机制目前尚不明确，但国内外的相关研究主要集中的胃肠动力学、肠神经递质、肠神经系统、Cajal间质细胞等方面。耻骨直肠肌长期反复发炎、充血、水肿，引起结缔组织增生纤维化，瘢痕化，最终导致耻骨直肠肌弹性减退，舒缩功能降低，造成排便困难，可导致出口梗阻性便秘［22］。我们的研究表明OOC的形成可能主要与黏膜下层及肌层中的与ICCs的功能及形态变化密切相关，ICCs的数量减少，功能减弱，可能是引起OOC发病的病理生理机制之一，而引起这以上变化的原因还有待于进一步的研究。