杨健，杨超，李剑辉

（1.台州医院 肝胆胰外科，浙江 台州 317000；2.台州医院 血液净化中心，浙江 台州 317000；3.浙江大学医学院附属第一医院 肝胆胰外科，浙江 杭州 310003）

肝癌为常见的恶性肿瘤，全球范围内病死率较高。肝癌的早发现、早诊断对提高疗效和改善预后具有重要作用。目前临床上应用最广泛的诊断肝癌的血清学标志物为甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），但单一指标的诊断敏感性和特异性有限[1]。microRNA（miRNA）为非编码小RNA，参与机体发育、新陈代谢、细胞增殖及凋亡、肿瘤发生和发展等过程。多种miRNA在肝脏中表达，miRNA表达量异常与肝癌的发生、发展关系密切。miRNA在血液中具有较高的稳定性，因此测定血清miRNA水平对肝癌的诊治具有重要价值[2]。microRNA-363（miR-363）在多种恶性肿瘤细胞中表达异常，参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[3-4]。但肝癌患者血清miR-363水平尚不清楚，本文拟探讨肝癌患者血清miR-363水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2018年12月台州医院肝胆胰外科收治的肝细胞肝癌患者86例作为肝癌组。其中，男性72例，女性14例；平均年龄（52.37±8.16）岁；平均肿瘤直径（4.65±1.24）cm；单发肿瘤37例，多发肿瘤49例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期19例，Ⅲ期38例，Ⅳ期7例；有转移42例，无转移44例；腹水31例，肝硬化47例，食管胃底静脉曲张15例，门静脉高压21例。选取同期本院健康体检者86例作为对照组。其中，男性68例，女性18例；平均年龄（51.79±9.42）岁。纳入标准：①肝癌组经病理确诊为肝细胞肝癌、首次诊治；②对照组均身体健康；③患者资料完整，签署知情同意书。排除标准：①其他恶性肿瘤者；②自身免疫性疾病者；③急、慢性感染性疾病者；④严重心、肝、肾功能异常者；⑤糖尿病、高血压等慢性疾病者。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经台州医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 标本采集抽取患者空腹静脉血4 ml，4℃、1 000 r/min离心10 min，分离血清，吸出上清液置于离心管中，4℃、5 000 r/min离心10 min，留取上清液置新的离心管中，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miR-363水平测定从-80℃冰箱中取出血清，室温解冻，待血清完全溶解后，取200μl至灭酶、灭菌EP管中，采用Trizol试剂提取总RNA，根据RT-PCR试剂盒（美国Sigma公司）说明书将RNA逆转录为cDNA，并置于-80℃冰箱中保存。利用NCBI数据库确定miR-363引物序列（正向引物：5'-ACAC TCCAGGTGGGAATTGCACGGTGTCCA-3'，反向引物：5'-TGGTGTGGTGGAGTCG-3'，长度22 bp），以U6为内参照（正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AAGGCTTCACGAATTTGCGT-3'，长度23 bp），采用RT-PCR测定血清miR-363水平，反应条件如下：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，共38个循环。以2-ΔΔCt法计算血清miR-363相对表达量。

1.2.3 血清AFP水平测定采用电化学发光法测定血清AFP水平，试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司。

1.3 诊断标准

1.3.1 肝硬化肝组织病理学检查同时表现为弥漫性肝纤维化和结节形成则可诊断为肝硬化[5]。

1.3.2 门静脉高压①巨脾；②血小板＜100×109/L 和/或白细胞＜4×109/L；③门静脉宽度＞14 mm或脾静脉宽度＞10 mm；④胃镜下胃底静脉曲张或存在腹水；⑤胃镜下食管静脉曲张。符合≥2项则可诊断为门静脉高压[6]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-363和AFP水平

两组血清miR-363相对表达量和AFP水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），肝癌组血清miR-363低于对照组，AFP高于对照组。见表1。

表1 两组血清miR-363相对表达量和AFP水平比较 （n =86，±s）

表1 两组血清miR-363相对表达量和AFP水平比较 （n =86，±s）

组别 miR-363 AFP/（ng/ml）对照组 1.00±0.07 3.26±0.24肝癌组 0.38±0.05 624.34±46.31 t值 66.838 124.307 P值 0.000 0.000

2.2 不同因素患者的血清miR-363相对表达量比较

不同TNM分期、有无转移患者的血清miR-363相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤个数、有无腹水、肝硬化、食管胃底静脉曲张、门静脉高压患者的miR-363相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 肝癌患者血清miR-363与AFP的相关性

Pearson相关性分析显示，肝癌患者血清miR-363与AFP呈负相关（r=-0.502，P=0.000）。

2.4 血清miR-363与AFP诊断肝癌的价值

血清miR-363、AFP分别以0.47和400 ng/ml作为临界值，绘制ROC曲线。miR-363、AFP及miR-363+AFP诊断肝癌的ROC曲线下面积分别为0.742（95% CI：0.740，0.747）、0.884（95% CI：0.881，0.887）和0.938（95% CI：0.935，0.941），敏感性分别为90.7%（95% CI：0.876，0.932）、87.2%（95% CI：0.843，0.900）和82.6%（95% CI：0.796，0.855），特异性分别为66.3%（95% CI：0.643，0.673）、80.2%（95% CI：0.782，0.824）和93.0%（95% CI：0.903，0.962）。见图1。

表2 不同因素患者的血清miR-363相对表达量比较 （±s）

表2 不同因素患者的血清miR-363相对表达量比较 （±s）

因素 n miR-363 t值 P值年龄 ＜60岁 47 0.41±0.10 1.932 0.057 ≥60岁 39 0.37±0.09性别 男 72 0.39±0.12 0.877 0.383 女 14 0.36±0.10肿瘤直径 ＜5 cm 44 0.40±0.11 1.929 0.057 ≥5 cm 42 0.35±0.13肿瘤个数 单发 37 0.39±0.10 1.030 0.306 多发 49 0.37±0.08 TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期 41 0.51±0.09 12.136 0.000 Ⅲ、Ⅳ期 45 0.30±0.07因素 n miR-363 t值 P值转移 有 42 0.33±0.06 10.454 0.000 无 44 0.49±0.08腹水 有 31 0.36±0.14 1.831 0.071 无 55 0.41±0.11肝硬化 有 47 0.37±0.09 1.680 0.097 无 39 0.41±0.13食管胃底静脉曲张 有 15 0.37±0.11 1.730 0.087 无 71 0.42±0.10门静脉高压 有 21 0.36±0.10 1.403 0.164 无 65 0.39±0.08

图1 miR-363、AFP及miR-363+AFP诊断肝癌的 ROC曲线

3 讨论

肝细胞肝癌起病隐匿、恶性程度高，早期诊断及手术切除是延长患者生存期的关键。影像学检查是发现肝癌的重要方法，但多数影像学检查发现的肝癌已为晚期，错过手术机会。除了影像学方法外，血清AFP水平在肝癌的辅助诊断中也具有重要价值，但单一AFP对肝癌的诊断效率有限，有部分早期肝癌患者被漏诊，因此探讨肝癌的其他血清学诊断标志物具有重要价值[7]。

miRNA在人类基因调控中发挥重要作用，某个miRNA的变化可引起数百个靶基因表达水平异常，并可引起转录组基因表达谱的改变[8]。转录基因表达谱的改变在多种疾病的发生、发展中发挥重要作用，多种恶性肿瘤的发生可能与miRNA表达谱的改变有 关[9]。肝脏组织含有丰富的miRNA，肝脏中的miRNA可通过病毒颗粒分泌、外泌体分泌、凋亡及坏死等过程释放进入外周血中，引起血液循环中miRNA水平异常。因外周血中miRNA表达相对稳定，因此血清miRNA在早期肝癌的诊断中具有一定指导价值[10]。

miR-363为miRNA的一种，具有广泛生物学效应，在多种恶性肿瘤细胞中表达异常，参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[11]。如miR-363可影响喉癌细胞增殖、侵袭和凋亡[12]；miR-363-3p通过靶向丙酮酸脱氢酶B调节胶质瘤细胞生长和侵袭[13]；miR-363通过调节上皮-间质转化抑制上皮性卵巢癌的顺铂化学抗性[14]；miR-363可调节肝细胞肝癌奥沙利铂耐药 性[15]；miR-363可作为结直肠癌的诊断标志物[16]。miR-363在肝癌中的作用也受到大家关注，如姜哲 等[17]研究发现miR-363可通过靶向调控E2F3影响肝癌细胞HepG2的增殖和凋亡。胡建军等[18]研究发现肝癌HepG2细胞中miR-363水平下调，过表达miR-363可抑制HepG2细胞活力并诱导其凋亡，由此推测miR-363在肝癌发生、发展中可能发挥重要作用。介于miRNA在外周血中相对稳定，外周血中miR-363水平及其意义也受到大家关注。QI等[19]研究发现，水痘患者血清miR-363水平异常，血清miR-363水平可用作诊断水痘-带状疱疹病毒感染的生物标志物。AFAF等[20]研究发现，慢性淋巴细胞白血病患者血清miR-363水平升高。目前miR-363在肝癌中的作用主要限于细胞水平研究，肝癌患者血清miR-363水平尚不清楚。本文研究发现肝癌患者血清miR-363水平降低，血清miR-363与肝癌TNM分期、有无转移有关。血清miR-363与AFP相比，诊断肝癌的敏感性较高，但特异性较低。miR-363在多种恶性肿瘤中表达异常，本研究发现miR-363在肝癌诊断中的特异性低，故miR-363单独诊断肝癌价值有限，但血清miR-363与AFP联合可显著提高AFP对肝癌的诊断价值，可见血清miR-363水平在评估肝癌严重程度中具有一定价值。考虑过表达miR-363可以抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞凋亡，当miR-363水平下降时，其对肝癌细胞增殖的抑制作用及对肝癌细胞凋亡的诱导作用下降，从而促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡。本研究结果发现，低水平miR-363可能促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡，从而诱导肝癌的发生、 发展。

综上所述，肝癌患者血清miR-363水平降低，检测血清miR-363水平在评估肝癌严重程度和辅助肝癌诊断中具有一定价值。