任培中，苗 青，杨 斌，范艺龄，樊茂蓉，3△

(1. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029； 2. 中国中医科学院西苑医院，北京 100091； 3. 北京中医药大学，北京 100016)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一种以进行性肺功能损害及呼吸困难加重为特征的慢性致死性疾病[1]，对人类健康危害极大且缺乏理想的治疗手段，其发病机制复杂，至今尚未完全阐明。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积是IPF的主要病理改变之一[2]。相关研究表明[3]，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)系统的失衡可能会导致其异常沉积。因此，调节MMPs/TIMPs平衡可能具有抑制ECM过度沉积的作用。本研究通过建立肺纤维化大鼠模型，观察通肺络补宗气方对模型大鼠肺功能、MMP9/TIMP1平衡以及纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)、Ⅳ型胶原(Type IV Collagen，Col Ⅳ)表达水平的影响，探讨通肺络补宗气方治疗IPF的部分分子生物学机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠96只，体质量(120±10)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供(许可证编号 SCXK(京)2014-0004)，常规饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，12 h光照和夜循环，温度(22±2)℃，湿度(55±5)%。

1.2 实验药物及制备

通肺络补宗气方药物组成：生黄芪60 g,升麻6 g,旋覆花15 g,威灵仙12 g,海浮石15 g,三棱10 g,莪术10 g,甘草6 g，均由河北神农北京药业有限公司提供，每剂药由中国中医科学院西苑医院煎药室制备为100 mL浓缩液；乙酰半胱氨酸泡腾片(海南赞邦制药有限公司，批号H20140449)。

1.3 主要仪器和试剂

博来霉素(美国Invitrogen，批号r25001-8)；FN抗体、Col Ⅳ抗体、MMP9抗体和TIMP1抗体(美国Abcam，批号分别为ab2413，ab6586，ab58803，ab38978)；即用型免疫组化试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司，批号KIT-9701)；动物肺功能分析系统和动物呼吸机(北京贝兰博科技有限公司，型号分别为AniRes2005，RES3020)；生物组织包埋机(金华市益迪医疗设备有限公司，型号YD-6 L)；石蜡切片机(美国Thermo，型号Finesse325)；自动化智能型正置研究级显微镜(Olympus，型号BX40)；电泳仪电源和电泳槽(美国BIO-RAD，型号分别为PowerPacTM1645050，Mini-PROTEAN Tetra System 1658000)；化学发光凝胶成像系统(美国Azure Biosystems，型号C600)。

2 方法

2.1 分组及造模给药

适应性喂养1周，大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、中药初期干预组、中药中期干预组、中药后期干预组、西药初期干预组、西药中期干预组和西药后期干预组，参考文献复制肺纤维化大鼠模型[4]。中药初、中、后干预组分别自造模后第3、14、28天起给予通肺络补宗气方14.07 mg·kg-1·d剂量灌胃，给药90 d；西药初、中、后期干预组分别自造模后第3、14、28天起给予N-乙酰半胱氨酸150 mg·kg-1·d剂量灌胃，给药90 d；模型组给予等量生理盐水灌胃。各组大鼠给药剂量按照人与大鼠体表面积转换系数0.018及成人常规服用剂量换算[5]，给药体积为10 mL·kg-1。

2.2 肺功能检测及取材

实验第19周分别于各组大鼠中随机选择9只进行肺功能检测及取材。以1%戊巴比妥钠溶液(60 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，约5 min后行气管插管，将大鼠仰卧放入体描箱，连接气管插管与体描箱气路，FVC检测压力参数设定30cmH2O，待数据曲线稳定后开始采集，经软件处理后计算出所需肺功能各项指标数值，包括用力肺活量(FVC)、0.3 s内平均流速(FEVO.3/FVC%)、呼气峰流速(PEF)、最大通气量(MVV)和动态顺应性(Cdyn)。肺功能检测后处死大鼠，无菌、低温条件下提取肺组织，右肺中叶上半部分置于10%中性福尔马林固定液中固定，右肺中叶下半部分置于冻存管中，液氮冷冻后置-80 ℃冰箱保存。

2.3 免疫组化检测

采用免疫组化法检测大鼠肺组织中FN和Col Ⅳ的表达部位及表达水平。取切片脱蜡至水，枸橼酸溶液中加热进行抗原修复，依次滴加试剂A(过氧化氢阻断剂)室温孵育，试剂B(动物非免疫血清)室温孵育，一抗4 ℃孵育过夜，试剂C(生物素标记的羊抗兔)室温孵育，试剂D(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶)室温孵育，DAB显色，苏木素复染30 s，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。于光镜下拍摄图像,将采集的图像应用Image-pro Plus 6.0图像分析软件进行分析,以免疫组织化学染色阳性信号累积光密度(IOD)值做半定量分析。

2.4 Western Blotting检测

采用Western Blotting法检测大鼠肺组织中MMP9和TIMP1的表达水平。取适量冻存肺组织提取全蛋白并进行蛋白定量；常规制备SDS-PAGE胶，取样品进行电泳，电转至PVDF膜，待转膜完毕后，将膜转移至平皿，加入封闭液(含5%奶粉的TBST)置于摇床上室温封闭1 h，加一抗室温轻摇孵育1 h后4 ℃孵育过夜；一抗孵育完毕，加入二抗(1∶2000)，室温孵育1 h；二抗孵育完毕，化学发光显色，放入凝胶成像仪中显影；应用Quantity One软件分析MMP9、TINP1及β-actin条带灰度值，计算MMP9、TINP1与β-actin灰度值的比值作为其各自的相对表达量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 通肺络补宗气方对肺纤维化大鼠肺功能的影响

表1显示，模型组大鼠FVC和Cdyn水平与空白组比较显著降低(P<0.01)，中西药各干预组大鼠FVC水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中药初期干预组和中药中期干预组大鼠Cdyn水平较模型组显著增高(P<0.05)；模型组大鼠FEV0.3/FVC、PEF及MVV水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05),中西药各干预组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 通肺络补宗气方对大鼠肺功能相关指标的影响

注：与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05

3.2 通肺络补宗气方对肺纤维化大鼠肺组织中FN、Col Ⅳ表达的影响

图1、2表2显示，FN染色为棕黄色，主要集中在肺血管、支气管周围、肺泡间隔及增生的间质细胞胞质内；模型组大鼠FN表达水平较空白组显著增高(P<0.01)，中西药各干预组大鼠FN表达水平较模型组显著降低(P<0.01)，中西药各干预组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。Col Ⅳ染色显示为棕黄色，其显色区域与FN显色区域基本相同；模型组大鼠Col Ⅳ表达水平较空白组显著增高(P<0.01)，中西药各干预组大鼠Col Ⅳ表达水平较模型组显著降低(P<0.05)，中西药各干预组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：K. 空白组；M. 模型组；Z-3. 中药初期干预组；Z-14. 中药中期干预组；Z-28. 中药后期干预组；X-3. 西药初期干预组，X-14. 西药中期干预组；X-28. 西药后期干预组图1 各组大鼠肺组织FN免疫组化结果(×200)

3.3 通肺络补宗气方对肺纤维化大鼠肺组织中MMP9/TIMP1表达的影响

表2图3显示，模型组大鼠MMP9表达水平较空白组显著增高(P<0.01)，中药初期干预组大鼠MMP9表达水平较模型组降低(P<0.05)，其余各组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中西药各干预组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠TIMP1表达水平较空白组均显著增高(P<0.05)，中西药各干预组大鼠TIMP1表达水平较模型组显著降低(P<0.05)，中西药各干预组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：K.空白组；M.模型组；Z-3.中药初期干预组；Z-14.中药中期干预组；Z-28.中药后期干预组；X-3.西药初期干预组；X-14.西药中期干预组；X-28.西药后期干预组图2 各组大鼠肺组织Col Ⅳ免疫组化结果(×200)

表2 通肺络补宗气方对大鼠肺组织中FN、Col Ⅳ蛋白IOD值及MMP9/TIMP1蛋白相对表达量影响比较

注：与空白组比较:**P<0.01；与模型组比较:#P<0.05;与模型组比较:##P<0.01

注：K. 空白组；M. 模型组；Z-3. 中药初期干预组；Z-14. 中药中期干预组；Z-28. 中药后期干预组；X-3. 西药初期干预组；X-14. 西药中期干预组；X-28. 西药后期干预组图3 各组大鼠肺组织MMP9、TIMP1 western blotting条带图

4 讨论

IPF属于中医学“肺痹”“肺痿”“喘证”等范畴，多因气虚而起，在此基础上痰瘀等病理产物相继出现，伏于肺络，日久则气、痰、瘀三者交互影响，正气愈虚而邪气愈盛，导致本病缠绵难愈[6-7]。通肺络补宗气方是临床治疗IPF的有效方剂，具有益气升陷、疏通肺络、化痰活血的功效。相关研究证实[8]，其治疗IPF疗效显著，可提高患者的活动耐力及生活质量，稳定患者肺功能。

肺功能进行性损害是IPF的重要临床特征，其损害程度与患者死亡率具有明显的相关性[9]，故稳定患者肺功能在IPF的治疗中具有重要意义。研究表明[10]，ECM的过度沉积与IPF肺功能进行性下降存在密切相关性。生理状态下的ECM沉积是对机体损伤的修复反应，而这种修复反应时间过长或修复过度时则成为致病性纤维化，增厚的ECM会阻碍组织功能，并可能导致器官衰竭[11]。FN和Col Ⅳ是ECM的重要组成部分，其异常表达是ECM过度沉积的具体体现。FN在博来霉素所致肺损伤的早期炎症阶段即开始出现聚集，表达量逐渐增加，其异常沉积贯穿肺纤维化发生发展的全过程[12]。Col Ⅳ是基底膜的重要组成部分，在IPF发生发展过程中出现异常沉积导致间质增厚。本研究中，模型组大鼠肺功能FVC和Cdyn数值较空白组均出现下降，中药初期和中期干预组大鼠Cdyn水平高于模型组，中药各干预组大鼠FN、Col Ⅳ的蛋白染色区域明显小于模型组，蛋白表达量明显低于模型组，表明通肺络补宗气方可通过减少FN、Col Ⅳ等ECM的过度沉积起到改善大鼠肺功能的作用。

ECM过度沉积是IPF的特征性病理改变，其成因与肺组织中MMPs/TIMPs表达失衡密切相关。MMPs主要功能为降解ECM，但其活性可被TIMPs抑制，过量的TIMPs抑制MMPs不利于ECM的降解，容易导致肺泡间质中ECM的过度沉积，促使肺纤维化的发生[3]。MMP-9属于基膜型MMP, 其活性可被TIMP-1抑制。有研究证实[13-14]，在肺纤维化的动物模型中，MMP-9 和TIMP-1 的蛋白表达均明显增高，且MMP9/TIMP1始终处于一种动态失衡状态。在本研究中，模型组MMP9和TIMP1的表达量较空白组均有增加，且MMP9和TIMP1的增幅明显不同呈失衡状态，与文献报道一致。此外本研究发现，中药初期干预组大鼠MMP9和TIMP1表达水平均低于模型组，中药中期和后期干预组大鼠MMP9表达水平与模型组比较差异无统计学意义，但TIMP1表达水平均明显低于模型组，中药各干预组大鼠FN、Col Ⅳ的蛋白表达量明显低于模型组，表明通肺络补宗气方可抑制MMP9和TIMP1表达量的异常升高，且能调控MMP9/TIMP1平衡来增强MMP9活性，进而起到减少FN、Col Ⅳ等ECM过度沉积的作用。

综上所述，本研究结果表明，通肺络补宗气方可抑制大鼠肺纤维化的发生发展，改善肺纤维化大鼠肺功能，其机制可能与调节MMP9/TIMP1平衡以增强MMP9活性，进而减少FN、Col Ⅳ等ECM的过度沉积相关，这些作用机制的揭示为通肺络补宗气方的临床应用提供了理论基础和实验依据。