肖祖飞 王玲玲 曹璐瑶 廖文轩 金志农* 李 凤

吕雄伟1 张北红1 赵 姣1

(1.南昌工程学院江西省樟树繁育与开发利用工程研究中心，南昌 330099； 2.江西省科学院生物资源研究所，南昌 330096)

柠檬醛猴樟(Cinnamomumbodinierivar.citralifera)是指枝叶精油主成分主含柠檬醛的猴樟，属樟科樟属植物，特产我国，分布于云南、四川、湖北、湖南、贵州等省，尤以贵州分布最广[1]。柠檬醛猴樟树形优美、冠大阴浓，材质坚实、有光泽、有香味，枝叶可提取精油，是重要的园林绿化、用材、油用树种。目前，对其的研究有形态解剖学[2]、生态学特性[3]、栽培与繁育[4]、造林技术[5]、抗逆性[6]、精油的提取与化学成分分析[7]等方面，除抗寒性研究较多外，其他方面研究均较少，关于猴樟组织培养研究未见报道。本文以柠檬醛猴樟一年生半木质化枝条为材料，研究采集季节、消毒时间和激素对柠檬醛猴樟茎段组织培养的影响，同时探索柠檬醛猴樟生根组培苗的炼苗、移栽技术，旨在为柠檬醛猴樟的无性繁殖提供理论依据，为更好开发与利用柠檬醛猴樟提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自南昌工程学院樟树种质资源圃的5年生柠檬醛猴樟。

1.2 试验方法

1.2.1 材料采集时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

分别于2017年5月中旬、7月中旬和9月中旬采集生长健壮的一年生半木质化枝条，剪取带1～2个芽的茎段(1.5～3.0 cm)，冲洗2 h，置于超净工作台，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞(HgCl2)消毒5 min，接种在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培养基，每瓶1个茎段，30瓶，3次生物重复。接种30 d，统计污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.2 消毒时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

于2017年5月中旬,选取生长健壮半木质化枝条，剪取带1～2个芽的茎段(1.5～3.0 cm)，冲洗2 h，置于超净工作台，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞进行消毒，消毒时间分别为3、5、7和9 min，用无菌水冲洗3～5次，茎段放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种在MS+1.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA培养基，每瓶1个茎段，30瓶，3次生物重复。接种30 d，统计污染率、褐化率和腋芽萌芽率。

1.2.3 激素浓度对柠檬醛猴樟茎段萌芽诱导培养的影响

于2017年5月中旬,选取生长健壮半木质化枝条，剪取带1～2个芽的茎段(1.5～3.0 cm)，冲洗2 h，置于超净工作台，75%酒精的浸泡30 s，用无菌水冲洗3～5次，用0.1%的升汞进行消毒5 min，用无菌水冲洗3～5次，茎段放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种在MS培养基，添加6-BA(0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.20、0.40 mg·L-1)。每个处理30瓶，每瓶1个茎段。接种30 d，统计腋芽萌芽率。

1.2.4 激素浓度对柠檬醛猴樟增殖培养的影响

挑选生长健壮、叶片舒展光亮、株高3～5 cm的无菌苗，修剪成茎段，茎段至少带有一叶一芽(1.5 cm)，接种在MS培养基，添加6-BA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，IBA(0.05、0.10、0.15、0.20 mg·L-1)。每个处理20瓶，每瓶7～8个茎段。继代培养30 d，统计增殖芽数、苗高、茎粗。

1.2.5 柠檬醛猴樟生根诱导培养研究

挑选生长健壮、叶片舒展光亮、株高3～5 cm的无菌苗接种于1/2MS培养基，添加IBA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)，每瓶7～10株。生根培养25 d统计生根率、根数、根粗和根长。

1.2.6 柠檬醛猴樟生根苗炼苗和移栽技术研究

生根培养20～22 d，将组培生根苗移至透光25%～30%，温度25～30℃的大棚内炼苗7～10 d。用自来水清洗干净生根苗根部培养基，置于带有少量清水的托盘。移栽前将生根苗用0.5%多菌灵粉剂进行消毒30 min，之后移入装满基质的无纺布袋中央，用喷壶浇透水。之后保持基质湿润，见干即浇，每次浇透。移栽2个月后统计成活率。

1.3 数据统计与分析

株高、根长用米尺测量、地径、根粗用游标卡尺测定。采用Excel2010软件进行数据的录入、整理和方差分析。

污染率(%)=(污染的外植体数/接种的外植体数)×100

(1)

褐化率(%)=(褐化的外植体数/接种的外植体数)×100

(2)

萌芽率(%)=(萌芽的外植体数/接种的外植体数)×100

(3)

增殖系数=新增殖芽数/原接入芽数

(4)

生根率(%)=(生根苗数/接入株数)×100

(5)

2 结果与分析

2.1 材料采集时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

由表1可知，不同时间采集材料对柠檬醛猴樟茎段初代培养有显著影响，随采集时间的延后，污染率和褐化率显著提高，萌芽率显著降低。5月中旬，外植体污染率最低，为17.78%，显著低于7月中旬(28.89%)和9月中旬(41.11%)，褐化率也是最低，为11.11%，与7月中旬差异不显著，显著低于9月中旬(21.11%)，5月中旬萌芽率最高，高达56.67%，显著高于7月中旬和9月中旬，9月中旬萌芽率最低，为25.56%。

表1 材料采集时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

Table 1 Effects of material collection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

采集时间Collection time污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)5月中旬Mid-May17.78±2.43c11.11±1.89b56.67±4.12a7月中旬Mid-July28.89±1.67b13.33±1.51b40.00±2.65b9月中旬Mid-September41.11±3.18a21.11±1.20a25.56±1.67c

注：表中同一列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Notes:Different normal letters in the same column indicate significant differences among treatments atP<0.05.The same as below.

2.2 消毒时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

由表2可知，随着消毒时间的增加，柠檬醛猴樟茎段组织培养污染率逐渐降低，褐化率逐渐升高，萌芽率先升高后下降。柠檬醛猴樟茎段消毒3 min，污染率高达65.56%，显著高于其他处理，消毒5和7 min污染率在15%～20%，二者差异不显著，显著高于消毒9 min，消毒9 min污染率最低，为8.89%。柠檬醛猴樟茎段消毒9 min褐化率最高，为56.67%，显著高于其他处理，其次是消毒7 min，褐化率为24.44%，消毒5和3 min，褐化率较低，分别为12.22%和5.56%。消毒5 min，萌芽率最高，为57.78%，显著高于其他消毒时间，其次是消毒7 min，萌芽率最低的是消毒3 min。因此，5月份采集柠檬醛猴樟半木质化枝条，修剪成1～2芽茎段，0.1%升汞消毒5 min，进行初代培养，萌芽率最高，污染率和褐化率较低。

2.3 激素浓度对柠檬醛猴樟茎段萌芽诱导培养的影响

由表3可知，柠檬醛猴樟萌芽率随6-BA浓度的增加而升高，随IBA浓度的增加而降低，当6-BA浓度为1.0 mg·L-1、IBA浓度为0.05 mg·L-1时，柠檬醛猴樟萌芽率达到最高60.00%，其次是2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率最低的是1.0 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1IBA，萌芽率为16.67%。因此，诱导柠檬醛猴樟茎段萌芽最适培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA。

表2 消毒时间对柠檬醛猴樟茎段培养的影响

Tabel 2 Effect of disinfection time on stem segment culture ofC.bodinierivar.citralifera

消毒时间Disinfection time(min)污染率Pollution rate(%)褐化率Browning rate(%)萌芽率Germination rate(%)365.56±3.42a5.56±0.37d10.00±1.67c518.89±1.85b12.22±1.03c57.78±2.59a716.67±1.40b24.44±3.16b35.56±2.26b98.89±1.17c56.67±3.95a16.67±1.73c

表3 激素配比对柠檬醛猴樟茎段萌芽诱导培养的影响

Tabel 3 Effects of hormone ratio on stem segment germination induction culture ofC.bodinierivar.citralifera

处理Treatment接种茎段Number of stem segment culture萌芽茎段Number of stem segment germination萌芽率Germination ratioMS+0.25mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA30723.33MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301136.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301860.00MS+2.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA301653.33MS+1.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA301240.00MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IBA30826.67MS+1.0mg·L-16-BA+0.4mg·L-1IBA30516.67

2.4 激素浓度对柠檬醛猴樟增殖培养的影响

由表4可知，在IBA浓度不变的情况下，随着6-BA浓度的增加，柠檬醛猴樟茎段的增殖系数先升高后稍降低的趋势。处理2，柠檬醛猴樟茎段增殖系数最高，为4.33，显著高于处理1，与处理3和处理4差异不显著。在6-BA浓度不变，柠檬醛猴樟茎段的增殖系数随着IBA浓度的增加呈现先基本不变，当浓度达到0.2 mg·L-1，增殖系数显著增加，显著高于其他处理。株高较大的是处理7(3.98 cm)、处理6(3.81 cm)和处理3(3.72 cm)，其次是处理1、处理2和处理5，最差的是处理4(3.40 cm)。各处理地径生长差异不显著。因此，柠檬醛猴樟最适增殖培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA。

2.5 IBA对柠檬醛猴樟组培苗生根的影响

2.5.1 柠檬醛猴樟组培苗生根过程基部形态变化

柠檬醛猴樟组培苗生根培养1～5 d，基部形态基本没有变化；培养7 d时，少部分组培苗基部膨大，有少量愈伤；培养11 d时，部分组培苗不定根突破表皮，不定根出现；培养14 d时，组培苗不定根进行生长，不定根明显(图1)，之后不定根增长、增粗生长。

表4 激素配比对柠檬醛猴樟增殖培养的影响

Tabel 4 Effects of hormone ratio on proliferation culture ofC.bodinierivar.citralifera

处理Treatment激素配比Hormone ratio(mg·L-1)6-BAIBA增殖系数Multiplication株高Plant height(cm)地径Ground diameter(cm)处理1Treatment 10.50.201.83±0.47c3.46±0.32cd1.14±0.11a处理2Treatment 21.00.204.33±0.73a3.67±0.17bcd1.04±0.05a处理3Treatment 31.50.204.08±0.61a3.72±0.06abc1.08±0.09a处理4Treatment 42.00.204.00±0.45a3.40±0.14d1.28±0.27a处理5Treatment 51.00.052.33±0.16b3.62±0.21bcd0.90±0.05a处理6Treatment 61.00.102.33±0.25b3.81±0.09ab1.15±0.18a处理7Treatment 71.00.152.00±0.08bc3.98±0.13a1.06±0.04a

图1 1.5 mg·L-1 IBA诱导柠檬醛猴樟组培苗生根过程Fig.1 Induction of rooting process of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera by 1.5 mg·L-1 IBA

2.5.2 IBA对柠檬醛猴樟组培苗生根的影响

由表5可知，IBA对柠檬醛猴樟组培苗生根有显著促进作用。随着IBA浓度的增加，生根率先升高后降低，1.5 mg·L-1IBA处理，生根率达到75%，显著高于其他处理，其次是2.0mg·L-1IBA处理(68.75%)，生根率最低的是0.5 mg·L-1IBA处理。1.5 mg·L-1IBA处理，根数最多，达到3.5，其次是2.0 mg·L-1IBA处理(3.06)，0.5 mg·L-1IBA处理，根数较少，为2.40。根长和根粗各处理差异不显著。因此，柠檬醛猴樟最适生根培养基为1/2MS+1.5 mg·L-1IBA。

2.6 柠檬醛猴樟生根苗的移栽和苗期管理

生根培养20～22 d，将组培生根苗移至透光25%～30%，温度25～30℃的大棚内炼苗7～10 d。之后用医用镊子将生根苗取出，用自来水清洗干净生根苗根部培养基，置于带有少量清水的托盘。移栽前将生根苗放入40%多菌灵粉剂0.5%溶液中消毒5～10 min，用医用镊子小心将生根苗移入装满基质的无纺布袋中央，稍微压实基质，以防苗木基部松动，随即用喷壶浇透水。之后保持基质湿润，见干即浇，每次要浇透。根数大于3，移栽成活率可达80%以上，苗木木质化后可将苗移入大田定植(图2)。

表5 IBA对柠檬醛猴樟生根的影响

Tabel 5 Effect of IBA on rooting ofC.bodinierivar.citralifera

处理Treatment生根率Rooting rate(%)根数Number of root根长Root length(cm)根粗Root diameter(cm)1/2MS+0.5mg·L-1IBA31.15±3.83d2.40±0.21c4.79±09.47a0.74±0.08a1/2MS+1.0mg·L-1IBA40.00±3.15c2.63±0.16bc5.32±0.95a0.69±0.12a1/2MS+1.5mg·L-1IBA75.00±2.27a3.50±0.18a5.06±0.82a0.82±0.10a1/2MS+2.0mg·L-1IBA68.75±5.06b3.06±0.33ab5.28±0.64a0.71±0.07a

图2 柠檬醛猴樟组培苗定植Fig.2 Planting of tissue culture seedlings of C.bodinieri var. citralifera

3 讨论

组织培养具有操作简单、繁殖系数高、脱毒、可周年生产等优点，可以在短期内获得大规模苗木，满足市场需求，是木本植物快速、高效无性繁殖的主要方式。目前，关于猴樟的组织培养研究未见报道，而同属植物樟树的组织培养研究较多。

基本培养基是影响组织培养成功的关键，木本植物组织培养常用基本培养基有MS、DCR、B5、WPM等培养基，其中樟树组织培养采用较多的基本培养基是MS[8～9]，也有研究表明B5培养基比MS培养基更适合樟树愈伤组织的生长[10]，DCR基本培养基较适合樟树芽的培养[11]。本试验中柠檬醛猴樟茎段的诱导萌芽和增殖采用MS基本培养基，生根培养采用1/2MS培养基，获得较好的效果，关于其他基本培养基是否适合柠檬醛猴樟的组织培养有待进一步研究。

取材时间不同，外植体发育状况不同，生理状态不同，影响植物组织培养成功。外植体消毒时间太短，外植体消毒不干净，污染率高；消毒时间太长，污染率低，但对外植体杀伤力大，褐化严重。有研究表明一年中1～4月份采集香樟外植体接种，感菌率低，无菌活体获得率超过50%[12]。也有研究表明，香樟4～6月取材，感菌率最高，8月前后，感菌率最低[13]。本研究结果表明，5月中旬采集柠檬醛猴樟半木质化枝条，修剪成一叶一芽茎段，0.1%升汞消毒5 min，茎段腋芽萌芽率最高，褐化率和污染率较低。这可能与枝条木质化程度和枝条在环境中暴露时间有关，5月中旬，半木质化枝条生长旺盛，腋芽处于活动状态，细胞容易诱导，而且枝条与外界环境接触不久，表面灰尘、细菌较少。

外源激素是植物组织培养成功的关键因子，在外植体的诱导、不定芽的分化与增殖及芽苗生根培养过程中，外源激素发挥重要的作用。长期以来，对激素的研究一直停留在凭经验摸索的基础上，对于同一植物，所用激素种类和浓度说法不一。BA、NAA和IBA是植物组织培养中应用最广的激素。有研究表明6-BA对香樟芽的增殖影响较大，与低浓度的IBA配合使用有利于芽的增殖，采用MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA培养基进行芽的增殖，增殖系数最高，达到6.1。芽苗接入1/2MS+0.2 mg·L-1IBA培养5 d，之后转入1/2MS无激素培养基培养，生根率最高，达到93.6%，并且生根数大于3、最长根大于2 cm的苗超过80%[14]。MS培养基中加入Ca(NO3)2适合香樟初代培养，究其原因可能是：一方面可以提供苗木更多的Ca2+，同时NO3有利于K+、Mg2+、Ca2+等阳离子的吸收，另一方面可以避免初代的褐化。6-BA和IAA配合使用，香樟丛生芽分化正常，生长健壮，丛生芽诱导适宜培养基为MS2(MS+Ca(NO3)2)+4～5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，继代增殖培养基为MS2+3～3.5 mg·L-16-BA+2 mg·L-1IAA，生根培养基为MS2+3.0 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1IAA+50～100 mg·L-1氯化胆碱，生根率为85%[15]。也有研究表明GA3对芳樟不定芽的增殖有一定影响，芳樟在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1GA3培养基上，月增殖系数能够达到15[16]。本研究结果表明，柠檬醛猴樟茎段萌芽最适培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA，萌芽率为60%。柠檬醛猴樟增殖适宜培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA，增殖系数为4.33，适宜生根培养基为1/2MS+1.5 mg·L-1IBA，生根率为75%。