吴涵，陈滢，刘敏，王淑莹，张伟

（1 四川大学建筑与环境学院，四川成都610065； 2 北京工业大学城镇污水深度处理与资源化利用技术国家工程实验室，北京100124； 3 四川大学高分子研究所高分子材料工程国家重点实验室，四川成都610065）

引 言

在我国，污水处理厂多使用生物法处理污水[1]，该方法在常温下运行效果较好。但是我国北部地区及西部高寒地区常年低温（例如四川阿坝州高原常年气温为3.1～16.3℃[2]），使得微生物活性受到影响，硝化作用急剧下降，影响出水水质。有研究表明，温度对微生物代谢过程影响较大，特别是硝化菌容易受到温度的影响，温度低于15℃后，细菌生物活性变差[3]；低于5℃进入极端环境后，污水处理效果大幅下降[4]。改善这一问题的传统方法除调整传统的活性污泥法系统的运行参数之外[5]，主要有化学强化混凝[6]、人工湿地强化[7]、投加高效耐冷菌种技术[8]等强化低温污水的处理效果。近年来，大多数生物法处理低温污水的研究多集中在颗粒污泥培养[9]和生物强化技术[2]上，但其工艺措施仍有不足，甚至可能引起污泥膨胀问题[10]。耐冷菌的富集强化技术成为了解决方案之一。

序批式生物膜反应器（sequencing biofilm batch reactor，SBBR）工艺将活性污泥法和生物膜法相结合[11]，它增加了每单位反应器体积的生物量群的大小和微生物多样性，从而创造了提高污染物生物降解效率的条件，且填料的存在避免了污泥膨胀问题。近年来，随着微生物分子生态学研究的发展，以Illumina 为代表的高通量测序技术[12]因其测序成本低、信息采集量大、适用性广的优点逐渐被熟识，将高通量测序技术与污水处理菌种筛选相结合更有利于对生物膜微生物群落水平的分析和鉴定[13]。

本实验则旨在对以SBBR 方式运行的反应器进行逐步降温，并比较分别使用不同填料的三个反应器在低温下的出水水质差异。进一步对填料上的微生物进行16S rRNA 高通量测序。既利用SBBR工艺的优点，又在微生物群落水平上解释不同反应器理化指标的差异并识别出耐低温的污水处理微生物，同时对比选择出更有利于低温微生物生长的填料载体，为进一步富集低温菌，投入低温污水处理的使用提供依据和支撑。

1 实验部分

1.1 实验装置与材料

设计了3个有效容积800 ml的完全相同的反应器，放在同一恒温控制箱内，24 h 在线监测，结果显示，温度波动在±0.1℃内。低温实验阶段是在冬季进行，能够保证在预设温度内开展。三个反应器分别按填料比80%放置三种不同的填料，分别命名为A 反应器、B 反应器、C 反应器。三个反应器均以序批式方式运行，换水比为50%，每个温度下具体曝气时间、静置时间安排见表1。

A反应器使用普通商用聚乙烯悬浮填料作为实验对照组，形状规格为白色柱状，直径2.5 cm，厚1 cm；B反应器中为自制阳离子改性聚乙烯悬浮填料，淡黄色柱状，直径2.5 cm，厚1 cm；C 反应器为石墨烯改性聚乙烯悬浮填料，黑色柱状，直径2.5 cm，厚0.4 cm，具体填料样式如图1所示。

1.2 接种污泥及配水

图1 三种填料Fig.1 Fillers in three reactors

接种污泥为成都市某污水处理厂的回流污泥，其混合液悬浮固体浓度（mixed liquid suspended solids, MLSS）为(5500±50) mg/L。实验用水为模拟中试现场配制的生活污水，其化学需氧量(COD)为(300±40)mg/L，氨氮为(30.0±3.00)mg/L，总磷（TP）为(4.00±0.20) mg/L，并加入NaHCO3保证足够的碱度，使pH=6～8，设置生物膜培养的初始温度为25℃，三个反应器曝气流量一样，DO＞4.5 mg/L。

1.3 实验方案

实验具体方案如表1 所示，三个反应器除使用填料不同外，进水、接种污泥及浓度以及运行条件都完全相同。实验分为两个阶段：第一阶段为常温下生物膜培养驯化阶段：接种污泥后，三个反应器在25℃下运行140 个周期。在运行到第20 个周期时，COD 去除率达80%以上时，抖动填料后，排掉所有悬浮和脱落污泥。第二阶段为逐步降温正式运行阶段：在25、20、15、10、6和5℃下依次降温运行不同周期。每周期对应污染物去除负荷计算公式如式（1）所示

式中，LB为去除负荷，g 污染物/(m3·d)；n为一日之内的周期数，周期/日；Q为一周期内的进水流量，立方米/周期；C0、Ce分别为进水、出水污染物浓度，g/m3；Tc为一个处理周期的时间，h；V为反应器有效容积，m3；Ta为一个处理周期内反应的有效时间，h。

表1 实验方案参数Table 1 Experimental protocol parameters

各反应器脱氮表观活化能Arrhenius 计算公式如式（2）所示[14]

式中，r为脱氮速率，kg N/(m3·d)；Ea为表观活化能，J/(mol NH3-N)；R为摩尔气体常量，8.314 J/(kg·K)；T为热力学温度，K；A为指前因子。

1.4 水质检测方法

第一阶段每2 个周期，第二阶段每个周期取进水、出水水样进行水质测定。每个温度条件下最后一个周期取填料上的生物膜进行镜检观察。采用快速消解分光光度法（HJ/T 399—2007）测定COD，检测仪器为5B-2H 便携多参数水质分析仪；采用纳氏试剂分光光度法（HJ 535—2009）测定氨氮浓度，检测仪器为L5S 紫外分光光度计；采用电化学测量法测定DO，检测仪器为WTW Multi3430便携式溶氧测定仪；采用玻璃电极法测定pH，检测仪器为HI98128 pH 测试仪；采用重量法测定MLSS，检测仪器包括分析天平、101-2 电热鼓风干燥箱；微生物镜检仪器为OLYMPUS BX51 系统显微镜。

1.5 16S rRNA高通量测序

取5℃下稳定运行后的三个反应器填料上的生物膜进行测序。测序鉴定工作由罗宁生物公司完成，具体的实验方法如下：生物膜总RNA 提取使用RNeasy PowerSoil Total RNA Kit（QIAGEN 公 司）完成，随后使用5X All-In-One RT MasterMix（ABM 公司）逆转得到第一连cDNA 并定量。用KOD-Plus-Neo（TOYOBO）高保真酶对cDNA 进行PCR 扩增，PCR 所用引物已经融合了Miseq 测序平台的16S rDNA V4 通 用 引 物 ，515F 引 物 ：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R 引 物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。每个样本进行3个重复，每个PCR 反应终止于线性扩增期，PCR 结束后将同一样本的PCR 产物混合后进行电泳检测，使用胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA 片段。参照电泳初步检测结果，将PCR 回收产物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用Illumina 公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit (FC-121-3001/3003)建库试剂盒进行文库的构建。将混合好的文库用Illumina MiSeq 测序仪测序并分析。

1.6 测序数据分析方法

测序得到的原始下机数据经过拼接后，再根据Barcode 区分样品，使用UCHIME 算法去除低质量序列和嵌合体。利用UPARSE 算法在97%的相似性水平上进行OTU（operational taxonomic units）的聚类，筛选OTU 的代表性序列，使用SILVA 数据库进行物种分类信息的划分，对代表性序列进行比对并过滤，然后重构建进化树，过滤掉不需要的OTU 并进行重抽样，并计算各个分类水平上的丰度信息。统计和作图主要使用R、python 和java 等完成，用R分析微生物群落的Alpha多样性。

2 实验结果与讨论

2.1 反应器去除污染物效果

经过第一阶段长时间的生物膜培养，A、B 和C三个反应器COD 出水浓度分别达到26、37和39 mg/L，氨氮出水浓度分别为0.43、1.07和0.52 mg/L，均降低至《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2012）的一级A 类排放标准以下。第二阶段正式降温运行过程中，25℃时三个反应器出水水质相近。随着温度的降低，污染物的去除效果在不同温度以及不同反应器下产生了差异，A 反应器填料上的生物膜有部分脱落，B、C反应器生物膜生长情况较好。由于每次温度降低后微生物的活性都会受到影响，处理效果有所波动，所以取每个温度下运行最稳定的最后6 个周期的去除负荷、出水浓度和污染物去除率的平均值进行分析比较。

2.1.1 COD 去除效果 随着温度的降低，微生物的活性逐渐降低，如果不改变曝气时长，COD 去除效果会变差，为了达到排放标准对水质的要求，实验在第二阶段降温过程中延长了每周期的曝气时间，导致图2 中去除负荷随温度的降低而降低。25℃的平均去除负荷是5℃的近三倍，15℃与20℃相比去除负荷下降最快，三个反应的平均去除负荷由300 g COD/(m3·d)下降到100 g COD/(m3·d)，5℃和6℃的有机物去除效果相近。虽然总体的去除负荷有明显的降低，但使用三种不同填料的SBBR 在相同温度下的去除负荷相近，对有机物的去除效果差异不大。

温度下降的过程中，为了保证出水水质达标延长了曝气时间，由图3可知，在选取了合适的去除负荷后，三个反应器COD 去除率均达到80%以上，其出水浓度都稳定在50 mg/L 以下，且没有明显随温度降低而变化的趋势。这说明不同温度下，选取了合适的去除负荷，填料的类型对COD 的去除不会有太大影响。

图2 不同温度下COD的去除负荷箱式图Fig.2 COD removal load at different temperatures

图3 不同温度下COD出水情况统计图Fig.3 COD effluent at different temperatures

2.1.2 氨氮去除效果 在污水处理中，氨氮是监测出水水质的重要指标之一，较高的氨氮浓度易造成水体富营养化等水质问题。

温度降低影响了硝化菌的活性，使出水氨氮浓度难以达标。采取延长曝气时间来降低去除负荷保证至少一个反应器出水浓度达标。由图4 可知，25℃时，三个反应器的氨氮去除负荷并无太大差别。与COD 去除情况不同的是，随着温度的降低，三个反应器对氨氮的去除情况产生了差异，使用自制填料的B反应器的氨氮去除负荷在各个温度下均高于其他反应器。箱式图的垂直延伸线代表了所有数值在四分位数以外的可变性，由图对比可知随着温度的降低，B 反应器的氨氮去除效果可变性较小，尤其是在6℃和5℃时，B 反应器去除负荷数值较集中且极端值偏差不大，稳定性高于A、C 反应器。这说明B反应器中的自制填料更有利于微生物的稳定生长，其中的微生物在低温下对氨氮的去除能力更强，效率更高，且去除效果更加稳定，出现极端情况的可能性小。

由图5可得，经过第一阶段的长期驯化，三个反应器氨氮去除率均稳定在90%以上。在25℃时出水情况基本相同，降温到20℃时出现差异，A反应器氨氮出水浓度为13.7 mg/L，B 反应器为4.36 mg/L，C反应器为14.1 mg/L，B 反应器远好于A、C 反应器的出水效果。随着温度的继续降低，每个温度下B 反应器的去除率始终较高。在5℃时，三个反应器中氨氮的出水浓度分别为14.1、3.79 和14.1 mg/L，B 反应器出水浓度始终达标。另外，图6 为A、B、C 三个反应器脱氮速率与热力学温度的关系图，由Arrhenius 计算公式得到A、B 和C 三个反应系统的表 观 活 化 能 分 别 为68.96、57.48 和62.98 kJ/mol。Arrhenius 公式可用来量化生物反应对温度的依赖性[14]，表观活化能越高，对温度的变化越敏感。由此可知，接种原始污泥后，三个反应器的生物系统随着温度的改变发生了不同的变化，A、C 反应系统更易受到温度变化的影响，脱氮效果因低温变差，而B反应器的生物系统进化得更加稳定，抵抗低温能力较强，保证了出水水质达标。由以上可说明，以商用填料作为对照，B 反应器中的自制填料更有利于微生物在常温和低温下的附着和生长，适合进行深入研究与开发应用。

图4 不同温度下氨氮去除负荷箱式图Fig.4 NH3-N removal load at different temperatures

图5 不同温度下氨氮出水情况统计图Fig.5 NH3-N effluent at different temperatures

图6 三个反应器的脱氮速率与热力学温度的关系Fig.6 Relationship between nitrogen removal rate and thermodynamic temperature

表2 所示为本研究与近年其他文献报道的对低温条件下氨氮去除的研究。艾胜书等[15]利用多段多级AO 生物膜工艺在10℃条件下去除氨氮，降低温度后出水效果无法保证；张斌等[16]在四川高寒地区运用改良型A2/O工艺在低温下进行脱氮，其技术先进可靠，运行成本低，但10℃以下难以保证出水效果；Feng 等[17]利用沸石的离子交换作用和细菌的硝化作用在低温下同时吸收氨氮等污染物，在6℃低温下可达到较好的氨氮去除效果，但沸石的重复利用还需要人工投药进行解吸，操作烦琐；伍海全等[2]则利用生物强化技术对照投加经低温驯化后的耐冷菌和未经驯化的硝化菌观测出水中氨氮浓度，其菌种由LB 培养基培养得到，进水氨氮浓度较低，且实验运行周期较短，无法保证在有大量复杂污染物的生活污水中长期投用。本研究中以自制填料B 为载体培养的生物膜在低温5℃时，进水氨氮浓度为30 mg/L，去除负荷达到10.88 g 氨氮/(m3·d)时，出水氨氮浓度为3.79 mg/L，达到一级A 类标准的要求。可应用于北方冬季或高寒地区的污水处理厂。为探究与这些理化指标相关的微生物生长情况，实验进一步分析了反应器内的微生物生长情况与其群落结构之间的关系。

表2 近年来其他组对低温条件下氨氮去除的研究Table 2 Comparison of other groups in recent years on NH3-N removal under low temperature conditions

2.2 生物膜镜检结果

微型动物数量是表示污泥性质、运行环境和出水水质的指标[18]，但对其在不同温度下分布情况的研究较少。因本研究中B反应器出水效果远好于其他反应器，所以重点观察了B 反应器运行过程中微型动物中钟虫[19]、轮虫[20]和线虫[21]的情况。如表3 所示，在25℃时，钟虫、轮虫与线虫均数量较多且活性较高。20℃时钟虫、轮虫减少，线虫数量变化不大，在6℃时钟虫和轮虫基本消失，只剩下少量线虫。可见随着温度的降低，钟虫、轮虫都因不适应环境逐渐消失死亡，而线虫对其环境的改变仍有一定适应能力。

2.3 微生物群落结构分析

本研究采用16S rRNA 高通量测序技术来探究活性污泥中微生物的种类，从微生物群落结构水平解释理化指标上的差异性。

表3 不同温度下微生物镜检结果Table 3 Microbiological examination results at different temperatures

2.3.1 COD 去除相关菌属的分析 为了方便研究样本的物种组成及多样性信息，通常在97%的相似水平下进行OTU（operational taxonomic units）聚类分析。每个OTU 代表的是一类相似序列的集合，基于OTU 丰度表和注释后的分类信息表，可得到在属水平对各个样本的相对丰度表。而相对丰度较大的优势菌属则在反应体系中主导污染物的去除。

低温情况下，三个反应器对COD 的去除情况差别不大，且出水浓度都在50 mg/L 以下，高通量测序结果显示，在丰度前五十的OTU 中，与去除COD相关的OTU 种类多达14 种,丰度占全部菌属的53.73%（图7），而去除氨氮的相关菌属丰度低，种类少，由此可说明与COD 去除相关的菌属为反应体系中的优势菌，在低温下对污水的有机物处理效果较好。

为进一步解释三个反应器出水效果差异较小的原因，对去除COD 相关微生物中丰度最高的四种菌属的属水平丰度进行进一步的分析讨论，如表4所示。其中Saprospiracea为腐螺旋菌，在低温下易大量增殖且生长稳定[26]；Sphingomonas为鞘氨醇单胞菌，可分解有机物，且对环境变化具有极强适应能力，曾被发现于南极海冰中，对低温适应性强[27]。各反应器中四种菌属的丰度总和差别不大，这与实验结果中三个反应器出水COD 浓度全部达标且相差不大的结论相吻合。

表4 丰度最高的前四种去除COD微生物属水平丰度Table 4 Abundance of the top four depleted COD microbes

2.3.2 氨氮去除相关菌属的分析与筛选 前期的实验中，污泥中细菌即使死亡，由于DNA 没有及时降解，提取DNA 测定细菌种类时会干扰测定结果，本研究在高通量测序时，提取的是RNA 而不是DNA。主要是因为细菌的RNA 在细胞中的半衰期很短，降解快速，可以保证是活细菌中的RNA。采用提取总RNA 分析细菌组成的方法可以最大程度保证测序结果分析的是活菌。

图7 5℃时OTU丰度前五十菌属分布饼状图Fig.7 Distribution of the top 50 genus of OTU abundance at 5℃

与消耗COD 的菌属相比，与去除氨氮相关的菌属种类较少，丰度也很低，在高通量测序技术检测到的245 种菌属中，仅有10 种菌属是已有文献报道的与污水中氨氮的去除有关，这说明硝化系统的菌种对温度变化非常敏感，在5℃的低温下，大多数普通硝化菌进入休眠状态。如表5 所示，在这10 种菌属中，Ellin6067[29]、Cm1-21、MND1、Nitrosomonas和966-1均属于Nitrosomonadaceae（亚硝化单胞菌科），是城市污水处理厂活性污泥中氨氧化菌的优势菌[33]，该菌科在三个反应器中丰度分别为1.91%、5.10%和3.24%。Rhodocyclaceaesp.为常见的反硝化聚磷菌[30]，在三个反应器中丰度为1.02%、5.01%和0.68%，都是在B中丰度较高，利于去除氨氮。

表5 氨氮去除相关微生物属水平丰度Table 5 NH3-N removal related microbial abundance

Elstera属 于 α 变 形 菌 门（Alphaproteobacteriales）[28]，该菌属在A、C 反应器中丰度远高于B 反应器，与硝化菌在三个反应器中的分布情况相反，其具体功能目前没有文献报道。但是该菌属的16S rRNA 序列与巴西固氮螺菌（Azospirillum）的序列具有91%的相似性[34]。而巴西固氮螺菌具有将空气中的分子态氮转化成氨的固氮能力，由此推断Elstera菌属也可能有相似的作用，对氨氮的去除不利。

Nitrospira为常见的硝化螺旋菌，是硝化废水处理厂中的主要亚硝酸盐氧化细菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）[35]，直到2007 年，Alawi 等[31]在多年冻土中才发现了新的NOB——CandidatusNitrotoga，并且从活性污泥中富集了近亲。Candidatus Nitrotoga为 一 种 新 型 的 β 变 形 菌（Betaproteobacteriales），可在低温下功能性地代替Nitrospira进行硝化作用[36]，该菌属在三个反应器中丰度分别为0、1.05%和0.01%，同时Nitrospira在三个反应器中丰度分别为0、0.02%和0.01%，这可以说明B反应器中氨氮的去除与这两类硝化菌属在低温下良好的硝化作用有关。

另外，在接种原污泥的微生物种群分析中未发现CandidatusNitrotoga的存在，说明该菌种只能在低温下生存，是由实验在低温下驯化培养出来的，与韩梅等[36]的研究结果吻合。

以某一菌属在三个反应器中丰度总和为底数，计算其在各反应器中分布百分比，并以此作图8 可以将丰度较小的菌种在反应器中的分布差异放大，便于分析筛选虽然丰度小但造成了组间差异关键菌种。由图8 可见，大多数与氨氮去除相关的菌属在B 反应器中丰度较高，尤其是Candidatus Nitrotoga在A、C 反应器中分布几乎为零；Elstera在A、C 反应器中分布较多，在B 中分布较少。以上结果与前文中氨氮在不同反应器中去除效果不同的理化数据一致。

图8 与氨氮去除相关菌种在各反应器中所占百分比堆积条形图Fig.8 Percentage of strains associated with NH3-N removal in each reactor

图9 Alpha多样性指标箱式图Fig.9 Alpha diversity indicator

2.3.3 群落结构稳定性与多样性分析 在群落生态研究中，Alpha 多样性指数可以反映微生物群落的丰度（richness）、均匀性（evenness）及多样性等,在实际应用中微生物群落结构的稳定性直接影响到出水水质与处理效率。因此，选取Alpha 多样性指数的四个指标Chao1、Simpson、Shannon 和Faith’s PD来计算物种丰度与多样性。

如图9 所示，Alpha 多样性的四个指标在B 反应器中数值均大于A、C 反应器。Chao1 常用来估算物种总数，Simpson 则既考虑了物种的丰度也考虑了均匀性，Shannon 可估算物种多样性，Faith’s PD 用来表示系统发育的多样性[37]。由此结果可知，B 反应器中菌群丰度与多样性都较高，且数量分布均匀，发育可变性较大，其系统稳定性高，抵抗外界不利条件能力强，与B 反应器对污染物去除效果较好的理化结果相吻合。

3 结 论

（1）在低温环境下，各反应器COD 出水浓度均达到50 mg/L 以下，高通量测序结果显示，在5℃时与去除COD 相关的菌种丰度高，种类多，属于优势菌。其中Saprospiracea与Sphingomonas可适应低温环境正常代谢，且相关菌种总量在三个反应器中差异不大。

（2）经过逐步降温过程的驯化后，装有自制填料的B反应器在低温下对氨氮的去除效果优于A和C 反应器，5℃时，B 反应器出水氨氮浓度为3.79 mg/L，A、C 反应器的出水氨氮平均浓度均为14.1 mg/L。说明该填料优于普通商用填料和另一自制填料。对于污水处理厂使用填料的改善和优化具有较大意义。

（3）B 反应器的填料在低温条件下驯化富集了低温硝化菌CandidatusNitrotoga，其他常见硝化菌丰度也高于A 和C 反应器，且不利于氨氮去除的类固氮菌Elstera在B 反应器中丰度最低，微生物群落结构稳定性优于A 和C 反应器，高通量测序结果与理化指标相吻合。

（4）在温度降低的过程中，污水处理中常见的微型动物随着温度的降低逐渐减少，10℃时几乎消失，线虫的数量相比下降缓慢，5℃时仍有少量存活。