刘玉辉,王瑞芳,安晓萍,王 园,刘 娜,杨艳平,齐景伟

(内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心,内蒙古呼和浩特 010018)

我国是农业大国,玉米是我国最主要的农作物之一,与小麦、水稻并称为我国三大粮食作物,其年产量可达2亿多吨。玉米芯是玉米穗脱粒后的穗轴,属于玉米的副产物,其年产量可达4000万吨[1],主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。在工业上,玉米芯主要作为生产糠醛和木糖醇的原料[2],而在畜牧业上,由于其适口性差,且营养物质不易消化吸收,因此应用较少[3]。大部分玉木芯被直接作为燃料焚烧,或被丢弃,造成资源浪费、环境污染,因此对玉米芯进行深度开发利用具有极其重要的意义。

多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接到一起的大分子聚合物,在生物体内广泛存在,尤其是在植物体内。大量研究发现,植物多糖参与机体各种生命活动,具有多种生物学功能,如抗肿瘤、消炎杀菌、降血压、调节机体免疫力等[4]。研究证实玉米芯多糖具有抗凝血[5-6]、抗氧化和抗菌活性等生物作用,具有较大的研究和开发价值[7]。玉米芯中有大量的粗纤维(54.5%),能被提取出来的多糖很少,很多研究发现对玉米芯进行处理,可以增加玉米芯多糖的提取率,如丁存宝等[8]利用响应面优化超声波辅助法提取玉米芯中多糖,显示经超声波辅助处理后玉米芯多糖提取率可达7.19%,含量达到71.9 mg/g。已报道的玉米芯中多糖或木聚糖的提取方法有酸提法[9]、碱提法[10]、双氧水预处理法[11]、超声波辅助法[8]和菌酶协同发酵法[12],采用微生物发酵技术能够利用微生物的发酵作用,破坏植物细胞壁结构,使植物细胞壁中的多糖及其它生物活性物质较大程度的同步溶出,从而提高其产量及生物活性。

本实验室前期研究发现通过微生物发酵处理后麸皮[13-14]和玉米芯[12]中多糖含量明显升高,且发酵后的多糖具有较高的抗炎和抗氧化活性。因此,本研究拟在前期实验基础上研究发酵菌种、辅料种类、纤维素酶、料液比、发酵温度及发酵时间对玉米芯中多糖含量的影响,获得最佳发酵工艺;同时分析发酵与未发酵玉米芯中提取多糖的单糖组成,并评价其体外益生活性,研究玉米芯多糖组分与其活性的关系,本实验研究结果将为提高玉米芯多糖的提取效率和深度开发利用玉米芯资源提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米芯 购买于市场,干燥粉碎过40目筛;枯草芽孢杆菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)、酿酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119)、植物乳杆菌CGMCC1.2437(LactobacillusplantarumCGMCC1.2437)和嗜热链球菌CGMCC 1.2471(StreptococcusthermophilesCGMCC 1.2471) 中国微生物菌种保藏中心;营养肉汤培养基、麦芽汁培养基、MRS肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司;木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖、D-核糖 分析纯,美国Sigma;浓硫酸、苯酚、无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇 天津市汇杭化工科技有限公司。

SW-CJ超净工作台 上海新苗医疗器械;GX2型智力光照培养箱 宁波东南仪器有限公司;QYC-200恒温培养摇床 上海福玛实验设备有限公司;TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪仪器开发有限公司;微孔板分光光度计 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备

1.2.1.1 酿酒酵母菌悬液制备 将甘油冷冻保存的酿酒酵母菌接种到麦芽汁琼脂固体培养基,37 ℃活化48 h,挑选一株生长良好且形状规则的酿酒酵母菌落接种到麦芽汁液体培养基中,接菌量为5%,放在28 ℃,120 r/min的摇床中培养24 h进行复壮,从中吸取菌悬液到新的麦芽汁液体培养基中,放在28 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h,再吸取菌悬液到新的麦芽汁液体培养基中相同条件下进行培养24 h,重复一次,此时菌悬液菌体浓度为108cfu/mL[11]。

1.2.1.2 枯草芽孢杆菌菌悬液制备 将甘油冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种到营养肉汤琼脂固体培养基,37 ℃活化24 h,挑选一株生长良好形状规则的枯草芽孢杆菌落,接种到营养肉汤液体培养基中,放在36 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h进行复壮,从中吸取菌悬液到新的营养肉汤液体培养基中,放在36 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h,再吸取菌悬液到新的营养肉汤液体培养基中进行培养24 h,重复一次此时菌悬液菌体浓度为108cfu/mL[11]。

1.2.2 发酵条件的筛选

1.2.2.1 发酵菌种对玉米芯多糖含量的影响 将添加10%麸皮的玉米芯灭菌后分别接种8%酿酒酵母菌悬液、8%芽孢枯草杆菌菌悬液及4%酿酒酵母菌悬液+4%芽孢枯草杆菌菌悬液混合进行发酵处理,料水比1∶1.5 (g/mL),发酵温度35 ℃,发酵时间96 h,烘干粉碎用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最优发酵菌种。

1.2.2.2 辅料种类对玉米芯多糖含量的影响 在玉米芯中分别添加10%的豆粕、10%的麸皮及5%豆粕+5%麸皮,混合均匀后灭菌,接种8%芽孢枯草杆菌菌悬液,料水比1∶1.5 (g/mL),发酵温度35 ℃,发酵时间96 h,烘干粉碎用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最佳辅料种类。

1.2.2.3 纤维素酶添加量对玉米芯多糖含量的影响 在玉米芯中加入10%麸皮混匀灭菌,再分别加入0(空白对照组)、500、1000、1500和2000 U/g的纤维素酶,接种8%芽孢枯草杆菌菌悬液,料水比1∶1.5 (g/mL),发酵温度35 ℃,发酵时间96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最适纤维素酶添加量。

1.2.2.4 发酵料水比对玉米芯多糖含量的影响 在玉米芯中加入10%麸皮混匀灭菌,加500 U/g的纤维素酶,接种8%芽孢枯草杆菌菌悬液,料水比分别为1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75 (g/mL),发酵温度35 ℃,发酵时间96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最适料水比。

1.2.2.5 发酵时间对玉米芯多糖含量的影响 在玉米芯中加入10%麸皮混匀灭菌,添加500 U/g的纤维素酶,接种8%芽孢枯草杆菌菌悬液,料水比为1∶1.25 (g/mL),发酵温度分别为35 ℃,分别发酵0、48、72、96、120 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最适发酵时间。

1.2.2.6 发酵温度对玉米芯多糖含量的影响 在玉米芯中加入10%麸皮混匀灭菌,添加500 U/g的纤维素酶,接种8%芽孢枯草杆菌菌悬液,料水比为1∶1.25 (g/mL),发酵温度分别为33、35、37、39 ℃,发酵时间96 h,烘干粉碎,用于多糖提取及含量测定,以多糖含量作为评价指标筛选最适发酵温度。

1.2.3 玉米芯多糖的提取 发酵后的玉米芯于45 ℃烘箱中烘干,粉碎,称取1 g料添加20 mL蒸馏水,于80 ℃水浴锅中热水浸提40 min,取出后流水冷却,5000 r/min,离心15 min,弃沉淀,留上清待测[15]。

1.2.4 多糖含量的测定(苯酚-硫酸法) 以葡萄糖为标准品,采用苯酚硫酸法测定多糖含量[16],具体测定步骤为取1 mL稀释适宜倍数的玉米芯上清液,加入1 mL蒸馏水,再加入1 mL 6%苯酚溶液,然后加5 mL浓硫酸混匀,室温冷却20 min后,取200 μL加入到96孔酶标板中,使用酶标仪在490 nm下测定吸光度值。根据标准曲线计算多糖含量,标准曲线回归方程为y=0.3099x-0.0091,y代表糖的浓度(mg/mL),x代表吸光度值,相关系数R2=0.9989。

玉米芯多糖含量计算公式:

式中:A代表玉米芯多糖含量,mg/g;c代表稀释液多糖浓度,mg/mL;D代表稀释倍数;V代表上清液体积,mL;m代表玉米芯质量,g。

1.2.5 Sevage法去蛋白及醇沉粗多糖方法 在40 g/L的多糖溶液中按照其体积的0.2%加入中性蛋白酶,搅拌后40 ℃酶解1.5 h(用自封袋封口),沸水浴10 min使酶失活,冷却后5000 r/min,离心10 min。取上清液与sevage试剂(三氯甲烷∶正丁醇4∶1)按照体积比3∶1混合[17],使用磁力搅拌器充分搅拌30 min,之后5000 r/min,离心15 min,取上清再按体积比3∶1加入Sevage试剂重复上述步骤两次,以去除多糖溶液中残留的蛋白质。

将去蛋白后的多糖溶液放入旋转蒸发仪中蒸发浓缩,浓缩后的多糖溶液用80%的乙醇沉淀12 h,5000 r/min,离心10 min,弃上清,留沉淀,冷冻干燥48 h后备用。

1.2.6 玉米芯粗多糖的单糖组成分析 分别称取发酵和未发酵的玉米芯醇沉后粗多糖2 mg,加入0.5 mL浓度为2 mol/L三氟乙酸,120 ℃水解120 min,使用氮吹仪吹干。用单糖标准品配制成10 mg/mL溶液,取5 μL各个单糖标品溶液,加入0.5 mL浓度为2 mol/L三氟乙酸中,与样品同时在120 ℃下水解120 min,并使用氮吹仪吹干。向吹干后得到的样品中加入0.5 mL甲醇溶液(0.5 mol/L)和0.5 mL NaOH溶液(0.3 mol/L),混匀后在70 ℃水浴条件下反应30 min。冷却至室温,加入0.3 mol/L 盐酸0.5 mL中和。用0.5 mL氯仿反复萃取3次,5000 r/min离心5 min,取上清液,经0.22 μm 微孔滤膜过滤后待HPLC分析。

HPLC条件:SHISEIDO C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0);流动相B为乙腈水溶液(82∶18,v/v);流速为1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样量10 μL;采用VWD测器在245 nm处检测[18]。

1.2.7 发酵玉米芯粗多糖的益生活性评价 将甘油冷冻保存的植物乳杆菌或嗜热链球菌菌种接种到MRS肉汤琼脂固体培养基37 ℃活化48 h,挑选一株生长良好且形状规则的菌落,接种到MRS肉汤液体培养基中,36 ℃、静置厌氧培养24 h,取菌悬液备用。实验以无碳水化合物的MRS培养基作为基础培养基,设置三个处理组,分别为在基础培养基中添加a:20 mg/mL的葡萄糖,b:10 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL的发酵玉米芯醇沉粗多糖混合,c:10 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL的未发酵玉米芯醇沉粗多糖混合。所有培养基均121 ℃灭菌20 min,冷却后分别接种1%植物乳杆菌或嗜热链球菌菌悬液,36 ℃静置厌氧培养,每隔2 h在600 nm处测定培养基的OD值,以相对0 h处OD值的增长量绘制不同处理组中植物乳杆菌和嗜热链球菌的生长曲线。

1.3 数据处理

实验所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示,采用 SAS 9.2 统计软件进行ANOVA单因素方差分析,并用Duncan’s法进行多重比较,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种对玉米芯多糖含量的影响

如图1所示,接种8%枯草芽孢杆菌组玉米芯中多糖含量显著高于其他三个处理组(P<0.05),且4%酿酒酵母+4%枯草芽孢杆菌联合发酵组玉米芯中多糖含量显著高于接种8%酿酒酵母组(P<0.05),但与未加菌组相比无显著差异(P>0.05)。由上述实验结果可知,枯草芽孢杆菌是玉米芯发酵的最适菌种,可显著提高玉米芯中多糖的含量(P<0.05),这可能是由于枯草芽孢杆菌在进行生理活动过程中代谢产生的多种酶类如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等[19]对玉米芯产生降解作用,使得玉米芯多糖含量增加。因此,后期实验中通过接种8%的枯草芽孢杆菌进行玉米芯发酵。

图1 发酵菌种对玉米芯多糖含量的影响Fig.1 Effects of fermentation strains on polysaccharide contents of corn cob 注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图2～图7同。

2.2 添加不同辅料对发酵玉米芯中多糖含量的影响

如图2所示,与无辅料添加组相比,玉米芯中添加10%麸皮作为辅料进行发酵显著提高了玉米芯中多糖的含量(P<0.05),而添加10%豆粕组与添加5%豆粕和5%麸皮组玉米芯中多糖含量无显著提高(P>0.05)。由上述实验结果可知,添加10%麸皮作为辅料进行玉米芯发酵可使多糖含量显著提高(P<0.05),这可能是麸皮的营养价值更加丰富[20],一定程度上可改善发酵体系中的碳氮比例,从而促进微生物的生长及对玉米芯的发酵利用,使得玉米芯多糖的含量增加。因此,后期实验中选择在玉米芯中添加10%麸皮以改善发酵环境,提高玉米芯中多糖含量。

图2 辅料种类对玉米芯多糖含量的影响Fig.2 Effects of auxiliary materials varieties on polysaccharide contents of corn cob

2.3 纤维素酶添加量对发酵玉米芯多糖含量的影响

如图3所示,发酵前添加纤维素酶可显著提高发酵后玉米芯多糖的含量(P<0.05),随纤维素酶添加量的增加,发酵后玉米芯多糖含量显著升高(P<0.05),在酶添加量达到1000 U/g后达到稳定,其中添加1000 U/g纤维素酶时发酵玉米芯中多糖含量最高,但与500、1500和2000 U/g组相比无显著差异(P>0.05)。由上述实验结果可知,玉米芯发酵前添加一定量的纤维素酶进行预处理可显著改善玉米芯的发酵效果(P<0.05),这一结果与陆步诗等[21]对酶法降解玉米芯生产低醇饮料的研究结果相似,该研究中也发现添加一定量的纤维素酶可提高玉米芯中还原糖的含量,但玉米芯多糖含量与纤维素酶添加量间并不是线性增加关系,考虑到纤维素酶的成本,后期实验中选择添加500 U/g的纤维素酶进行玉米芯发酵。

图3 纤维素酶添加量对玉米芯多糖含量的影响Fig.3 Effects of cellulase addition on polysaccharide contents of corn cob

2.4 料水比对发酵玉米芯多糖含量的影响

如图4所示,玉米芯多糖含量在料水比为1∶1、1∶1.25和1∶1.5(g/mL)组无显著差异(P>0.05),当料水比增加到1∶1.75时玉米芯多糖含量显著低于料水比为1∶1.25和1∶1.5 (g/mL)组(P<0.05),考虑成本,后期实验中选择料水比1∶1.25 (g/mL)为最佳料水比进行玉米芯发酵。

图4 料水比对玉米芯多糖含量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide contents of corn cob

2.5 发酵时间对玉米芯多糖含量的影响

如图5所示,玉米芯多糖含量在发酵后48 h略降低,之后随着发酵时间的延长逐渐增加,在96 h后趋于稳定,其中发酵后72、96和120 h时多糖含量显著高于48h时多糖的含量(P<0.05),且发酵后96和120 h多糖含量显著高于发酵前玉米芯多糖含量(P<0.05)。发酵后48 h玉米芯多糖含量降低可能是:在发酵初期为维持生长益生菌将玉米芯中多糖作为碳源进行消耗,从而导致多糖含量降低,但随着发酵时间的延长,细菌代谢产生多糖,因此,玉米芯多糖含量增加并趋于稳定。基于以上实验结果,后期实验选择发酵时间为96 h做为最佳发酵时间。

图5 发酵时间对玉米芯多糖含量的影响Fig.5 Effect of fermentation time on polysaccharide contents of corn cob

2.6 发酵温度对玉米芯多糖含量的影响

如图6所示,各发酵温度玉米芯多糖含量差异不显著(P>0.05),但随着发酵温度升高玉米芯多糖含量先升高后降低,且在35 ℃条件下多糖含量最高为162.61 mg/g，同等条件下测定未发酵玉米芯多糖含量为135.33 mg/g，玉米芯多糖含量提高了20.16%。因此,后期实验选择35 ℃作为发酵玉米芯制备多糖的最优发酵温度。

图6 发酵温度对玉米芯多糖含量的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on polysaccharide contents of corn cob

2.7 发酵与未发酵玉米芯多糖的单糖组成分析

由表1可知,未发酵组与发酵玉米芯去蛋白醇沉后其多糖均由木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖和核糖组成。其中未发酵组玉米芯多糖主要由木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成,其摩尔百分比分别是29.44%、19.71%、16.49%、15.71%、15.16%;发酵组玉米芯多糖主要由木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成,其摩尔百分比分别是40.68%、23.56%、14.88%、11.32%,这一结果与胡妍[22]和Yu等[23]研究结果相似,这些研究中均发现玉米芯可溶性糖中木糖、阿拉伯糖含量最高。在本研究中,与未发酵组相比,发酵后玉米芯多糖含量提高了77.34%,木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的含量提高,而葡萄糖含量降低了57.29%。发酵后主要单糖含量的提高可能是在微生物发酵的作用下,玉米芯本身含有的葡萄糖和其他含碳物质被微生物代谢利用产生为其他种类的单糖。

表1 发酵与未发酵玉米芯粗多糖的单糖组成Table 1 The monosaccharide composition of fermented and unfermented corn cob polysaccharide

2.8 发酵与未发酵玉米芯粗多糖益生活性评价

图7 玉米芯粗多糖对植物乳杆菌和嗜热链球菌生长影响Fig.7 Effect of crude corn cobpolysaccharide on proliferation of Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophiles注:A为玉米芯粗多糖对植物乳杆菌生长影响, B为玉米芯粗多糖对嗜热链球菌生长影响。

如图7所示,由玉米芯粗多糖对植物乳杆菌和嗜热链球菌体外益生实验可知,三个处理组菌液OD值均随着培养时间的延长而增加,表明添加20 mg/mL葡萄糖和10 mg/mL葡萄糖+10 mg/mL的发酵或未发酵玉米芯粗多糖对植物乳杆菌和嗜热链球菌的生长均具有促进作用;在0～6 h添加玉米芯粗多糖组对植物乳杆菌增殖的促进作用显著优于仅添加葡萄糖组(P<0.05),而在8 h后20 mg/mL葡萄糖对植物乳杆菌的促生长作用更为显著(P<0.05)(图7A)。添加发酵玉米芯粗多糖或未发酵玉米芯粗多糖对嗜热链球菌的促生长作用在整个生长过程均显著优于仅添加葡萄糖组(P<0.05)(图7B)。植物多糖的益生作用已被广泛报道,Bashirat等[24]研究发现棕榈仁饼多糖对两种植物乳杆菌有良好的益生活性。Jayamanohar等[25]对红芸豆水提多糖的益生元活力进行研究,发现红芸豆多糖对植物乳杆菌生长有明显的促进作用。Wang等[26]研究菜籽粗多糖的体外益生活性,发现菜籽粗多糖可以明显的促进三种双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖。余茂元等[27]对霍山石斛多糖的分离纯化及其益生作用的研究,结果发现,在等量碳源下,添加一定量的霍山石斛多糖可以作为益生元,刺激菌体的活性,加快了自身的生长繁殖,本试验结果与其相同。

比较发酵与未发酵玉米芯粗多糖对植物乳杆菌和嗜热链球菌生长的影响,可见除6和8 h两个时间点外,在其余时间点添加发酵粗多糖组对植物乳杆菌的促增殖作用均显著强于未发酵粗多糖组(P<0.05)(图7A)。添加发酵玉米芯粗多糖组对嗜热链球菌的促生长作用在2 h后均显著优于添加未发酵玉米芯粗多糖组(P<0.05)(图7B)。发酵后玉米芯粗多糖的益生作用增强可能是由于玉米芯中木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖这些益生元物质在发酵后增加从而促进了菌体的生长。

3 结论

本研究以发酵玉米芯多糖含量为评价指标,对发酵菌种、辅料种类、纤维素酶添加量、料水比、发酵时间及发酵温度进行筛选,最终确定玉米芯发酵工艺为:使用8%的枯草芽孢杆菌进行玉米芯发酵并添加10%麸皮作为辅料,同时发酵前添加500 U/g纤维素酶进行酶菌协同发酵,最适发酵料水比为1∶1.25 (g/mL),发酵时间为96 h,发酵温度为35 ℃,在此条件下玉米芯多糖含量可达到162.61 mg/g。

通过研究玉米芯多糖的体外益生活性,发现培养基中添加玉米芯多糖可显著促进植物乳杆菌和嗜热链球菌的生长速度(P<0.05),具有很好的益生作用。根据单糖组成结果分析,玉米芯经过发酵后木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖均有明显的提高,因此,推测经过发酵处理后玉米芯粗多糖对植物乳杆菌和嗜热链球菌的促生长作用可能与玉米芯中木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖这些益生元物质的增加有关。