臧丽玉 徐晟林 耿学峰 姜恩德 吴从平 赵宝昌

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

脑卒中或脑血管意外，俗称“中风”，具有高残率和高死亡率等特点[1]，全球范围内严重危害人类健康和生命安全。它的发病是由于脑部动脉血管阻塞或血栓形成引起灌流区组织供血不足，或血管破裂引起出血性脑损伤等导致的脑血管疾病[2]。为深入探索其发病的分子机制，Helgadottir等[3]于2004年通过病例-对照研究，在冰岛和英国人群中首次定位了脑卒中的易感基因—ALOX5AP(Arachidonate 5-lipoxygenase activating protein)，它编码的蛋白质(5-脂氧合酶激活蛋白)可将花生四烯酸转化成白三烯。白三烯参与许多促炎过程，加速血栓的形成及动脉粥样硬化，最终导致心肌梗死或脑卒中。但ALOX5AP基因表达升高的调控机制尚不清楚，本研究通过克隆人ALOX5AP基因启动子并构建荧光素酶报告基因表达载体，用生物信息学预测分析其启动子序列、CpG岛及潜在转录因子结合位点，为阐明ALOX5AP基因转录调控机制奠定前期基础，为临床治疗缺血性脑卒中寻找新的策略。

1 材料与方法

1.1 质粒与试剂

荧光素酶报告基因载体pGL3-basic购于Promega公司，E-coli DH5α由山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学实验室提供。质粒小提试剂盒购于北京Tiangen公司，胶回收试剂盒购于北京Genstar公司，DNA抽提试剂盒、puf 高保真DNA聚合酶、DNA 1kb Marker、MluⅠ及HindⅢ限制性内切酶、DNA连接酶购于Takara(大连生物工程公司)。引物合成与DNA测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 引物设计与合成

在NCBI的Genebank数据库中检索人类ALOX5AP基因，并在Ensembl网站中查找转录起始点在基因中的准确位置(NCBI与Ensembl的网址见表3)，以转录起始点作为+1，获取上游-2 000 bp至-1 bp的序列。……