李 洋， 刘永康， 刘 保， 张国建,3， 梁鹏宽， 刘 维， 崔学文， 孙 群

(1. 四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610065；2. 西部战区空军医院普通外科， 成都 610021； 3. 四川大学轻纺与食品学院， 成都 610065；4. 四川省食品药品检验检测院， 成都 611731)

1 引 言

胆结石在亚洲地区是一种流行的进行性胆道疾病.与西方胆结石患者不同，其特点是弥漫性胆道扩张和细菌性胆管炎反复发作[1]，正常情况下，健康人的胆汁内无细菌生长，在胆结石患者的胆汁中通常可培养出一种或多种致病菌株[2]，这些致病菌多直接或间接来源于肠道，经奥狄氏括约肌(Sphincter of Oddi)逆行侵入胆道，在小肠肠壁黏膜受损的情况下也可通过门静脉血液循环系统入侵胆囊及胆道导致细菌感染[3]. 1887年Oddi首先报告了胆管末端在十二指肠的开口处存在有括约肌样结构，即被称之为奥狄氏括约肌，认为它具有抗十二指肠液返流的“阀门”作用，负责胆胰液分泌的调控与排泄[4]，也是胆管隔绝肠道细菌入侵的一道屏障，是胆道无菌环境的看门人.在医院治疗胆道结石病人的过程中，发现有一部分患者奥狄氏括约肌出现松弛(Sphincter of Oddi laxity，SOL)，在临床上如果外径为5.5 mm的胆道镜PENTAX能顺利通过无扩张程序Oddi括约肌到达十二指肠，则被诊断为SOL[5]. 目前关于奥狄氏括约肌松弛的流行病学研究和相关致松弛生化因子的研究已经很多，又有大量文献证明胆汁细菌与胆结石成石密不可分，但关于SOL胆结石病人的胆汁细菌组成和多样性的研究少见报道. SOL与胆汁微环境存在相互作用关系，可能是由于胆结石患者胆汁中SOL相关差异菌属通过某些代谢途径如细菌一氧化氮合酶(NOS)生成SOL松弛因子一氧化氮(NO)或者细菌某些炎症因子对患者胆红素等代谢产生影响，从而影响了奥狄氏括约肌的运动功能，导致肠内容物回流改变了胆道微环境[6]，破坏胆汁中胆固醇、胆汁酸与磷脂的平衡，进而造成胆结石形成和复发. 研究奥狄氏括约肌松弛与非松弛胆结石患者的临床指标差异和胆汁细菌组成以及多样性差异，可以分析探索细菌、奥狄氏括约肌与胆结石形成之间的关系.

第二代16S rRNA基因高通量测序技术[7]凭借其较低成本、通量高和测序的自动化以及快速准确全面获得样品细菌群落组成的优势，在如食品[8]、人体肠道[9]、胆道[10-11]、尿道[12]、皮肤[13-14]和口腔[15]等样品细菌群落研究中得到了广泛应用. 目前患有SOL胆结石患者的胆汁细菌组成和多样性少见研究报道，本研究基于Illumina MiSeq平台高通量测序研究胆结石患者胆汁细菌群落，分析比较了奥狄氏括约肌松弛与非松弛胆结石患者临床指标的差异以及胆汁细菌的组成、丰度和多样性的差异，找出与SOL相关的胆汁细菌，可能对临床诊断和治疗具有一定的指导意义并为研究SOL的细菌学致病机理打下了基础.

2 材料与方法

2.1 材 料

2017年5月至2018年9月期间，在排除肝胆肿瘤、先天性胆道畸形、肝硬化、胰腺炎和有奥狄氏括约肌切开术(EST)等既往肝胆手术史的患者的条件下，从解放军第452医院一共取得30个符合研究标准的原发性胆结石患者胆汁样品，其中取自奥狄氏括约肌松弛患者14个，奥狄氏括约肌正常患者16个，收集并记录患者术前肝肾功能和血常规等临床指标数据. 所有患者均知情并同意胆汁样本采集和临床指标收集.

2.2 方 法

2.2.1 临床指标采集处理 在对胆管进行任何入侵性手术操作之前，用5 mL无菌注射器从胆总管上端提取胆汁样本，并立即盖好针帽装入洁净冰盒中，保证1 h内进入实验室，于无菌操作间将取得的胆汁样品分装于3～4管(视胆汁样品量而定)无菌冻存管，一部分用于DNA提取和细菌分离培养，另一部分在液氮中速冻后储存于-80 ℃冰箱，用于后续实验备用.

2.2.2 DNA提取和PCR扩增 将胆汁样品从-80 ℃冰箱取出解冻，分装500 μL胆汁样品于1.5 mL 的Eppendorf管中，然后采用E.Z.N.A.© Stool DNA Kit(50)D4015-01(Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA)提取患者胆汁细菌基因组DNA，胆汁细菌基因组DNA提取后，使用Nano Drop 2000紫外-可见分光光度计测定DNA的浓度和纯度，然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带大小.使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S r RNA基因的V3-V4区在热循环PCR仪(Gene Amp 9700，ABI，USA)内进行PCR扩增. 每个样本三个重复加入不同标签序列(Barcode-index)后，使用Fast Pfu Polymerase聚合酶进行PCR扩增.扩增程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27个循环，循环结束后72 ℃最终延伸10 min. 然后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Axy Prep DNA 凝胶回收试剂盒(Axy Prep DNA Gel ExtractionKit，Axygen Biosciences，Union City，California，USA)切胶回收纯化PCR产物，将PCR产物用Quanti FluorTM-ST荧光定量系统(Promega，USA)进行检测定量.

2.2.3 Illumina Miseq高通量测序 扩增子以等摩尔浓度混合，送上海美吉生物医药科技有限公司Illumina Miseq PE300(Illumina，San Diego，California，USA)平台进行配对末端高通量测序.

2.2.4 数据质控和统计方法 使用软件FLASH(v1.2.7)处理MiSeq测序得的双端序列数据. 首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，使用软件FLASH(v1.2.7)和Trimmomatic(v0.03)对拼接得到的RawTags进行过滤，过滤质控后长度小于Tags长度75%的Tags，得到高质量的Tags数据，使用UCHIME v4.2软件鉴定并去除嵌合体得到优化序列. 然后使用软件UPARSE(version7.1 http://drive5.com/uparse/)按照97%相似性将优化序列划分可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)；使用Qiime平台和RDP Classifier(version 2.2)利用RDP classifier贝叶斯算法对照Silva(Release128)数据库对97%相似水平的OTU代表序列以0.7置信度阈值进行分类学分析并在各个分类水平统计各样本的群落组成. 为避免各样本序列差异，以最小样本序列数进行样本序列抽平，得到标准化OTU表进行后续统计分析. 使用单因素方差分析(IBM SPSS Statistics 22)对奥狄氏括约肌松弛和非松弛患者临床指标进行显著性检验(显著性水平α= 0.05). 基于抽平后的OTU表格，计算样本α和β多样性指数，利用R语言工具进行统计作Venn图，利用R语言工具vegan包进行群落热点作图. 利用STAMP软件进行基于Wilcoxon秩和检验(95%置信区间，bootstrap算法)物种差异两组比较分析找出组间差异物种(fdr多重检验校正P值). PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)即偏最小二乘法判别分析使用R语言mixOmics包中plsda进行分析和作图. PCoA分析，即主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis)使用R语言PCoA统计分析和作图.

3 结果和分析

3.1 胆结石患者临床指标差异

取得的30个原发性胆结石患者胆汁样品中，SOL胆结石患者(S组)胆汁样品14个，非松弛胆结石患者(C组)胆汁样品16个.C组和S组临床指标(包括性别、年龄)的单因素方差分析结果如表1所示，S组患者平均年龄64岁，C组患者平均年龄63岁，两组患者年龄并无显著性差别(P>0.05). 两组患者性别组成也无显著性差异(P>0.05). S组的胆结石患者其总胆红素TBIL(49.55 ± 7.95 μmol/L)、直接胆红素DBIL(30.2 ± 6.71 μmol/L)、间接胆红素IBIL(23.64 ± 1.50 μmol/L)显著(P< 0.05)高于C组非SOL患者的TBIL(27.27 ± 4.20 μmol/L)、DBIL(11.99 ± 3.05 μmol/L)、IBIL(14.68 ± 1.40 μmol/L)，其中IBIL差异更是达到了极显著水平(P<0.001). 而S组腺苷脱氨酶ADA水平(12.15 ± 1.11 U/L)则显著低于C组(20.45 ± 2.41U/L). 同时C组和S组TBIL、DBIL水平均高于指标正常范围(TBIL 3.4～26 μmol/L、DBIL 0～8 μmol/L)，S组IBIL指标高于正常范围(0～18 μmol/L)而C组在正常范围内，ADA水平两组均在正常参考值范围内(0～25 U/L)，但S组极显著(P< 0.001)低于C组，这表明S组患者有着较高的肝功能损伤和阻塞性黄疸发生率，可以推测SOL会加重患者肝功能损伤并可能会对胆汁感染细菌的种类和含量产生影响，这些待研究的差异菌属则可能进一步影响肝胆代谢和奥狄氏括约肌功能，加重患者病情.

表1 胆结石患者的临床指标差异分析

** indicates that the difference is extremely significant at the level of alpha=0.01, and * indicates that the difference is significant at the level of alpha=0.05.

可以看到两组患者总胆汁酸TBA(μmol/L)水平均升高超过参考值，S组TBA水平高于C组但没有显著性差异，这说明SOL患者的肝胆功能受到了更大的损伤. 两组患者TBA升高表明由于患者胆结石的阻塞，导致患者胆汁淤积肝胆代谢功能异常从而直接引起患者胆红素水平升高，而SOL患者由于奥狄氏括约肌不能正常排泄胆汁造成更严重的炎症和胆汁淤积，导致其总胆汁酸、胆红素水平显著高于非SOL患者(P< 0.05). 这些临床数据的非显著性差异指标如如年龄、性别、总蛋白、葡萄糖等对于患者SOL没有显著性影响，而差异指标如胆红素水平和ADA水平与SOL、胆汁细菌组成与多样性之间的关系则值得进一步探索.

3.2 胆结石患者细菌组成

本次高通量测序一共得到1 821条OTUs，属于33个门687个属，如图a所示C组含有1 196条OTU，S组含有1 387条OTU，C组独占434条OTU，S组独占625条OTU，两组共含有762条OTU. 由此可以知道S组有着更多的OTU数目和独有OTU数目，且S组独有的细菌OTU数目比C组多191条，两组共有的细菌OTU数目是C组独有OTU数目的1.75倍，通过这些OTU分布可以推测S组患者胆汁细菌有着更大的物种组成和多样性.由图b可知所有样本中丰度前5的OTU依次为OTU147(11.70%)、OTU178(8.36%)、OTU1174(6.55%)、OTU177(5.86%)、OTU1311(4.88%)，other为合并丰度小于1%的OTU占23.1%. 由OTU百分占比可以知道此次胆汁细菌高通量测序的物种覆盖度广、测序深度高.

图2为门水平和属水平群落组成柱状图，由图a可知门水平丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria，48.24%)，其次是厚壁菌门(Firmicutes，34.49%)、放线菌门(Actinobacteria，8.42%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，6.91%)和蓝藻菌门(Cyanobacteria，0.53%)， other为合并丰度小于0.05%的门，占1.40%. Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes这四个门占所有样本的97.88%，是患者胆汁细菌中的优势种群，可以看到在正常人肠道中含量很低的变形菌门和放线菌门在胆结石患者胆汁中大幅增加，分别超过了优势菌门厚壁菌门和拟杆菌门，可见其变形菌门和放线菌门在患者胆汁感染中起着不可忽视的作用. 由图b可知胆汁细菌中属水平丰度最高的细菌属为Escherichia-Shigella(11.36%)，其次为Enterobacter(8.11%)，Anoxybacillus(6.55%)，Klebsiella(5.69%)，Serratia(5.18%)，Enterococcus(4.79%)，Streptomyces(4.74%)，Lachnoclostridium(3.43%)，Massilia(3.32%)和Bacillus(3.31%)，others为合并丰度小于1%的属，占18.33%. 这些丰度前10的细菌加起来占胆汁细菌的56.48%，可见其感染细菌的种类分布很广.胆汁中含量丰富的大肠埃希菌(Escherichia-Shigella)、肠杆菌(Escherichia-Shigella)、克雷伯菌(Klebsiella)都是肠道正常定植菌，在胆汁中含量与在肠道类似，当这些条件致病菌通过松弛的奥狄氏括约肌或者肠壁黏膜感染胆道便成了不可忽视的病原菌，另外厌氧病原菌厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)含量在胆汁细菌中排第三，其有可能加重胆结石患者胆汁细菌感染.值得注意的是健康人肠道中含量很少的的肠球菌(Enterococcus)和Lachnoclostridium显著增加.附着肠壁黏膜中的肠球菌是一种重要的医院病原菌，其极易获得耐药性，耐药肠球菌通过肠壁黏膜容易引发患者尿路感染、腹腔感染、败血症等感染，对患者的临床诊治产生不利影响.这些在门水平和属水平上的菌属组成分布情况为下面继续深入挖掘寻找相关差异致病菌属打下了基础.

30个胆汁样品的高通量测序共得到1 340 273条高质量有效序列，单个样品序列长度为206～555，其序列平均长度为444.58 bp，按最小样本序列数抽平后其单个样品有效序列数为30 328，以97%相似度划分，得到1 821条OTUs. 如表2组间α多样性指数差异检验表所示各样本文库的覆盖率(coverage)范围均在99.7%以上，说明测序数据能够代表各样本细菌的真实情况. S组样本反应细菌物种丰富度的Sobs、Chao、ace指数和反应样本α多样性的Shannon、Simpson指数均高于C组但没有显著性差异，S组物种均匀度指数Shannoneven和Simpsoneven指数显著高于C组(P<0.05). 除了Simpson指数(Simpson指数值越大，群落多样性越低)S组小于C组外，其余指数S组均大于C组. 这说明了SOL患者比起非SOL患者其胆汁细菌群落含有更多物种，更大的物种多样性，更均匀的物种分布，这表明了患有SOL的胆结石患者往往有着更严重的细菌感染，更严重的细菌感染也就意味着更严重的肝胆功能损伤根据图3-A的PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)，即偏最小二乘法判别分析结果显示，除了S组的S6、S7和S13样品，C组和S组的其余样本在SOL分组条件下差异明显，SOL患者与非SOL患者的胆汁菌群组成存在明显差异，这说明SOL会影响胆汁感染细菌的种类. Fig 3-B 是基于Weighted-unifrac算法OTU水平的主成分(PCoA)分析，可以看到PCoA分析两组样品同样差异明显且S组样品更为分散，PC1是解释C组和S组细菌分布差异的主要成分，两组分布差异明显. 这些差异表明特定的胆汁细菌与胆结石患者括奥狄氏约肌松弛有着密切的相关性.

表2α多样性指数组间差异T检验

Tab.2Student′sttestofαDiversityIndexforthedifferencebetweengroups

EstimatorsC～Mean ± SdS～Mean ± SdPcoverage0.999 ± 0.000 350.999 4 ± 0.000 310.740Sobs144.940 ± 46.837157.360 ± 72.4940.577Chao157.980 ± 50.166175.070 ± 68.7420.439ace157.780 ± 49.763175.560 ± 61.9950.391Shannoneven0.383 ± 0.1850.519 ± 0.1770.050*Simpsoneven0.033 3 ± 0.021 20.060 ± 0.0370.019*Shannon1.936 ± 0.9972.634 ± 1.1060.080Simpson0.381 ± 0.2910.205 ± 0.1880.063

** indicates that the difference is extremely significant at the level of alpha = 0.01, and * indicates that the difference is significant at the level of alpha = 0.05.

图3 A.组间OTU水平的PLS-DA分析; B.组间OTU水平主坐标(PCoA)分析(基于Weighted-unifrac算法)

Fig.3 A. PLS-DA analysis between groups on OTU level; B. Principal co-ordinates analysis (PCoA) based on Weighted-unifrac algorithm between groups on OTU level

3.4 患者胆汁菌属差异

根据Fig 4-A门水平和Fig 4-B属水平基于Wilcoxon秩和检验的C、S两组物种差异比较分析结果图显示，丰度最高的Proteobacteria门S组含量低于C组，而Firmicutes、Actincobacteria和Bacteroidetes三个胆汁细菌主要构成门在S组丰度高于C组. 属水平S组肠球菌属Enterococcus和Lachnoclostridium显著多于C组，S组葡萄球菌属Staphylococcu丰度高于C组但没有显著性，丰度最高的Escherichia-Shigella、Enterobacter、Anoxybacillus三个属C组高于S组但没有显著性差异. S组与C组相比Enterococcus、Lachnoclostridium两个肠道机会致病菌属丰度增加，Escherichia-Shigella、Enterobacter、Anoxybacillus三个菌属丰度下降，这说明了SOL胆结石患者的胆汁与非SOL患者的胆汁相比感染了更多的肠道致病菌，这些感染细菌的差异可能是奥狄氏括约肌松弛引起的，而肠球菌等S组高丰度菌则可能通过分泌炎症因子等细菌代谢产物影响肝胆细胞代谢功能，从而影响胆红素代谢和胆汁平衡，然后对奥狄氏括约肌功能造成影响. 这些细菌的感染也可能通过刺激肠道免疫淋巴细胞和影响奥狄氏括约肌细胞内源性NOS酶的活性来对奥狄氏括约肌功能造成影响，进一步加重胆结石患者感染病情并引起胆结石的复发.

4 讨 论

本研究发现胆结石患者中奥狄氏括约肌松弛组的总胆红素TBIL、直接胆红素DBIL、间接胆红素IBIL显著(P< 0.05)高于奥狄氏括约肌正常组，而腺苷脱氨酶ADA水平则显著(P< 0.05)低于非SOL患者. 目前有文献报道胆红素与人体疾病如糖尿病[16]、精神分裂症[17]、直肠癌[18]、胆结石[19]等有着密切联系. 胆红素的代谢过程是IBIL在血液中白蛋白结合后运输到肝脏并转化为DBIL并由胆汁分泌进入肠道，然后DBIL被大肠细胞和大肠杆菌等分泌的β-葡糖醛酸糖苷酶水解成IBIL，大部分再由厌氧细菌还原和氧化后形成尿胆素，其大部分随粪便排除，小部分被重新吸收利用[20]. SOL患者TBIL的显著升高可能意味着因为奥狄氏括约肌的松弛患者胆汁排泄功能受到影响，且其胆肠道缺乏分解代谢胆红素的细菌种属，从而导致其胆红素水平过高. ADA水平在临床上常用于判断肝炎，罗秋红[21]研究指出血清ADA对鉴别黄疸具有重要的临床意义，且肝细胞性黄疸患者组的血清ADA水平为(30.55 ± 12.79 U/L)显著高于阻塞性黄疸患者组的血清ADA水平(12.15 ± 5.28 U/L)(P< 0.01)，其阻塞性黄疸血清ADA水平与本研究一致也是在正常范围，本研究胆结石患者中SOL组ADA水平较非松弛组显著下降意味着SOL有利于患者梗塞性黄疸的缓解. 值得一提的是患者总胆汁酸TBA(μmol/L)水平均升高超过参考值，S组TBA水平高于C组但没有显著性差异. 这表明由于患者胆结石的阻塞，导致患者胆汁淤积肝胆代谢功能异常从而直接引起患者胆红素水平升高，而SOL患者由于奥狄氏括约肌不能正常排泄胆汁造成更严重的炎症和胆汁淤积，从而导致其总胆汁酸、胆红素水平显著高于奥狄氏括约肌正常患者. 另有文章报道[22]，胆红素水平升高会显著影响内皮型一氧化氮合酶NOS3，而NOS产物NO作为神经递质[23]参与奥狄氏括约肌调控，结合本研究可以推测胆结石患者胆汁中细菌的NOS酶对奥狄氏括约肌松弛和胆红素水平的升高可能存在一定影响.

目前研究胆结石患者奥狄氏松弛与胆汁细菌群落结构相关性的文章很少，Liang 等人[5]研究发现与非SOL的患者相比，SOL患者表现出更严重的炎症，变形杆菌门和厚壁菌门是患者胆汁中分布最广的细菌类群，尤其是肠杆菌科，同时发现SOL患者具有更多的菌群，其Bilophila、Shewanellaalgae等病原菌群落较丰富，无害菌减少. 本研究16S rRNA基因高通量测序结果则显示患者胆汁细菌α多样性除了均匀度都没有显著性差异，患者胆汁优势菌为变形菌门、厚壁菌门和放线菌门. SOL松弛组丰度显著高于(P< 0.05)奥狄氏括约肌非松弛组的菌属为肠球菌属和Lachnoclostridium属. 对于本研究发现的奥狄氏括约肌松弛影响的差异菌株，其相关作用机制文献报道较少. Golińska 等人[24]研究发现肠球菌强粘附于肠上皮，形成生物膜，具有抗氧化防御机制，对炎症过程影响最大. Llorente 等[25]研究发现肠道肠球菌数量的增加和转移，会促进小鼠酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的进展，加重实验小鼠乙醇诱导的肝部炎症. 由此可以推测SOL患者胆汁肠球菌的丰度的显著增加会导致病人更加严重的炎症反应，加重患者病情，肠球菌对奥狄氏括约肌的松弛、ADA水平和胆红素代谢也可能存在潜在的影响. 对于Lachnoclostridium属，除了近几年有文献报道从肠道[26]和尿道[27]分离培养出Lachnoclostridium菌株之外，其他关于此菌属的文献研究报道较少，对于其可能的致病机制还有待进一步研究.

本研究基于Illumina MiSeq平台高通量测序研究胆结石患者胆汁细菌群落，统计发现SOL与非SOL胆结石患者在胆红素水平和ADA水平上差异显著，奥狄氏括约肌松弛与非松弛胆结石患者胆汁中的细菌组成和多样性也存在着显著差异，差异菌属如Enterococcus和Lachnoclostridium可能对SOL有潜在影响. 这些差异同时也可能与胆结石患者胆红素代谢、腺苷脱氨酶水平的异常存在潜在联系，这为SOL胆结石患者的临床治疗和研究SOL的细菌学致病机理打下了基础.