张斯汉，黄耿，张新洲，潘富林★

（1.深圳市龙岗区人民医院肾内风湿科，广东 深圳；2.深圳市人民医院，广东 深圳）

0 引言

骨关节炎（OA）是影响广大老年患者的常见疾病，随着我国人口老龄化社会形势日益严峻，OA带来的社会影响、经济负担日趋严重。OA病理表现主要为炎症反应及关节软骨破坏，彩超和磁共振可以发现早期软骨侵蚀。然而患者此时并无明显特异性表现，关节平片不能发现软骨破坏，临床往往被忽视，而晚期OA内科治疗方法，常常需要外科关节置换才能改善症状。故OA的早期诊疗非常关键，目前尚无特异性血清学标志物。血小板反应蛋白-1（TSP-1）由凝血酶激活的血小板产生[1]，故被命名血小板反应蛋白或凝血酶敏感蛋白。TSP-1家族包括TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5[2]，本实验观测到TSP-1在OA患者软骨细胞表达上调，有望成为OA早期诊断的特异性标志物。中药对骨关节炎的作用一直是研究的热点，复元胶囊是临床有效的复方制剂，在多个研究中显示了对OA有肯定的疗效。本实验设计了TSP-1在OA软骨细胞的表达及复元胶囊对其抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

TSP-1 ELISA试剂盒 上海晶抗生物有限公司；CD-47 ELISA试剂盒 上海经科化学有限公司；白介素-1β 试剂 Sigma 试剂公司；人源性软骨细胞株 上海拜力生物科技公司； ALP ELISA试剂盒、type Ⅹ Collagen ELISA试剂盒、TaKaRa RNA 提取试剂盒、TSP-1多克隆兔抗鼠一抗、TSP-1羊抗兔二抗、GAPDH抗体、DAB显色试剂盒、Abcam 公司；SAB总蛋白提取试剂盒购自南京莱富赛公司；BCA蛋白检测试剂盒自广州威佳生物科技公司；TSP-1、GAPDH引物由深圳华大基因公司合成。

1.1.2 仪器

1.1.3 药品

复元胶囊 重庆希尔安药业公司生产，仅供试验使用；塞来昔布 辉瑞制药公司。

SD大鼠12只，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证编号20120001。

1.2 方法

1.2.1 OA细胞模型造模

软骨细胞经2次传代后，取第三代细胞，加入浓度为10ng/mL的IL-1β，孵育24h，收集培养液，3000rpm离心15分钟，取上清，按ALP ELISA试剂盒、type Ⅹ Collagen ELISA试剂盒步骤操作，检测OA软骨细胞早期改变标志物Ⅹ型胶原、碱性磷酸酶（ALP）[3]。

1.2.2 含药血清制备

大鼠随机分为3组，每组4只。各组大鼠分别予复元胶囊大、中、小剂量，即 2222.9mg/kg、743.3mg/kg、371.65mg/kg[4]，大鼠每天灌胃2次，正常喂养，连续5天后，断头取血，500×g离心，取上清，置于56℃水浴灭活30min，过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存，备用。

1.2.3 分组及给药

此外，目前大部分研究仅基于临床疗效对阿司匹林的获益进行评价，而缺乏对于经济性的考量。基于此，本研究结合临床疗效，从经济性的角度对阿司匹林是否适用于我国全人群CVD一级预防进行药物经济学评价，以期为相关临床实践提供参考。

见表1。

各组细胞培养箱孵育72小时，分别收集上清液及软骨细胞，备用。

1.2.4 ELISA法检测各组细胞上清液TSP-1 CD-47的表达

上清液3000rpm离心15分钟，弃去沉淀，按照TSP-1、CD-47 ELISA试剂盒说明操作，测定各组TSP-1 CD-47相对表达量，结果见图2、图3。

表1 软骨细胞分组及给药

1.2.5 RT-PCR检测TSP-1 CD-47 DNA表达

备用软骨细胞加入TRIZOL试剂提取软骨细胞总RNA，琼脂糖凝聚检验RNA完整性，DEPC水处理RNA后紫外分光光度计检测其浓度和纯度（保持OD260/280在1.8-2.0之间），按照PCR说明书完成mRNA逆转录为cDNA，通过在Gene Bank选择鼠源性TSP-1 CD-47和GAPDH（内参）的mRNA的全基因系列，使用软件设计TSP-1 CD-47和GAPDH的引物，TSP-1上游引物，正向：5’ TTCCGGACCGATCCGATTC 3’， 反 向：5’ GACGAGTTCTCTGTTTACCCTGA 3’； GAPDH 上游，正 向 引 物：GTGCTAGCCGCATCTAGTAG 3’，反 向 引 物：5’CGATTGTGCCGTCGAACTTA 3’，以cDNA为模板进行RT-PCR法扩增mRNA，并对产物进行定量分析，结果见图4。

1.2.6 Western-blot检测TSP-1 CD-47蛋白表达

用RIPA蛋白提取试剂提取总蛋白，按照BCA protein Assay kit步骤定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭 1小时，分别加入 TSP-1（1：500）CD-47（1：500）和GAPDH（1：2000）一抗，4℃冰箱过夜。羊抗兔二抗室温孵育30分钟，ECL法显色，凝胶成像系统成像，结果见图5。

1.2.7 数据处理

采用SPSS 17.0处理，多组之间采用卡方检验，两组之间比较采用t检验，P值小于0.05有统计学意义。

2 结果

OA细胞模型构建，见图1，软骨细胞经IL-1β孵育后，检测OA早期标记物ALP、Ⅹ Collagen，结果显示，模型组和阴性对照组上述标记物的表达均有显著差异，表明造模成功，可进行下一步试验。

图1 OA细胞模型表达ALP、Collagen10的情况

复元胶囊含药血清孵育后，TSP-1在软骨细胞上清液表达的情况见图2：和空白组比较，TSP-1在模型组（F组）及实验组（A、B、C组）表达上调，差别有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，复元胶囊大、中、小剂量组均能明显抑制TSP-1的表达，差别有统计学意义（P＜0.05），其中，复元胶囊大剂量组抑制作用最明显，且大中小剂量组之间体现剂量依赖性。

图2 复元胶囊对TSP-1在OA细胞模型上清液表达的影响

复元胶囊含药血清孵育后CD-47在细胞上清液表达情况，见图3：和空白组比较，CD-47在模型组（F组）及实验组（A、B、C组）表达上调，差别有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，复元胶囊大、中、小剂量组均能明显抑制CD-47的表达，差别有统计学意义（P＜0.05），其中，复元胶囊大剂量组抑制作用最明显。

图3 复元胶囊对CD47在OA细胞模型上清液表达的影响

复元胶囊干预后OA细胞模型后，TSP-1 mRNA表达情况，见图4：和空白组比较，TSP-1mRNA在模型组（F组）及实验组（A、B、C组）表达上调，差别有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，复元胶囊大、中、小剂量组均能明显抑制TSP-1mRNA的表达，差别有统计学意义（P＜0.05），其中，复元胶囊大剂量组抑制作用最明显，且大中小剂量组之间体现剂量依赖性。

图4 复元胶囊对TSP-1 mRNA在OA细胞模型表达的影响

复元胶囊干预后OA细胞模型后，TSP-1 蛋白在OA细胞内表达情况，见图5：和空白组比较，TSP-1蛋白在模型组（F组）及实验组（A、B、C组）表达上调，差别有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，复元胶囊大、中、小剂量组均能明显抑制TSP-1蛋白的表达，差别有统计学意义（P＜0.05），其中，复元胶囊大剂量组抑制作用最明显。

图5 复元胶囊对OA细胞模型表达TSP-1 蛋白的影响

3 讨论

TSP-1在正常组织含量很少，在组织损伤、慢性疾病过程中上调，除了分布在实质细胞，还分布在血液[5]、尿液[6]、脑脊液[7]等体液中。在本实验中检测到TSP-1在OA细胞中及细胞外液均有上调，证实OA疾病过程中由软骨细胞过表达TSP-1，且上调的TSP-1可以进入细胞外基质。

TSP-1除了在血小板、中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞分泌外，在RA[8]、SLE[9]、硬皮病[10]等风湿免疫病过程中均有表达上调，以及本实验中在OA软骨细胞中明显表达增加，证实TSP-1可以在软骨细胞、滑膜细胞等细胞产生，在风湿性疾病的慢性炎症过程中发挥了重要作用。

用IL-1β孵育软骨细胞制作OA的细胞模型，是一种比较多见的试验方法，但是否造模成功，目前仍然没有可靠的依据。本研究中采用ELISA方法检测OA软骨细胞早期终端分化的标志物ALP及type Ⅹ Collagen，可以衡量造模成功与否，相对于使用电镜观察细胞的微细结构，或者使用免疫组化观察细胞质与细胞核的改变，方法更简单可行，对于下一步试验具有重要的意义。

CD47为表达于细胞表面的膜受体，同时又是抑制性受体信号调节蛋白a的配体，本研究用ELISA法检测了CD47在软骨细胞外液含量增多，不排除膜蛋白的脱落或者其他分泌机制造成。联合检测TSP-1及其受体CD47，对于早期OA的诊断有很大意义，如果临床上能抑制TSP-1过度表达或者抑制其受体CD47的活化，可能对骨关节炎的治疗有积极的意义。

在体内和体外实验中，复元胶囊均已经被证实对OA有肯定的治疗作用，其一，复元胶囊可以抑制炎症介质和细胞因子的释放，如抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、iNOS 等的释放[11][12][13]；其二，复元胶囊抑制软骨细胞凋亡，促进其增殖[14]；其三，复元胶囊还可以抑制软骨细胞外基质的降解、抑制基质金属蛋白ADAMTS-4、ADAMTS-5酶的活化[15][16]；TSP-1是 ASAMTS聚糖蛋白酶家族内含的系列，本实验中可以观察到复元胶囊可以明显抑制TSP-1的表达，且有剂量依赖性，或许可以解释其保护OA软骨基质，抑制聚糖蛋白酶ADAMTS的活化，延缓聚糖蛋白被降解的机制。复元胶囊是否可以抑制CD47在软骨细胞OA模型中mRNA及蛋白表达，将在后续研究中继续进行。