冯卫红 郭 娜 米 阳 曹 丽

西北妇女儿童医院(西安,710000)

胎儿生长受限(FGR)在我国发病率为5%～10%[1],是导致围产儿死亡的首要原因,且增加远期代谢综合征、神经行为发育异常等发生风险[2]。FGR可单独出现,也可与妊娠期疾病如妊娠期高血压疾病(HDCP)、妊娠期糖尿病(GDM)等伴随存在[3]。既往对GDM所致围产儿并发症的研究多集中于巨大儿,而对FGR的研究相对较少,机制未阐明增加了GDM管理难度。临床研究发现,内质网应激反应可介导滋养细胞凋亡,与GDM及其相关并发症的发生发展有关[4]。脂质代谢多在内质网中发生,内质网应激反应可引起脂质及营养素累积异常,加重细胞损伤及凋亡[5]。本研究从血清学与胎盘滋养细胞的生物学行为方面探讨GDM伴FGR孕妇的可能发病机制,观察脂代谢异常与内质网应激及疾病发生的可能关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月—2019年6月在本院接受规律产检并分娩的GDM孕妇126例。纳入标准：①符合GDM诊断标准[6]；②单胎妊娠；③既往无长期服药、酗酒、吸烟史；④无饮食限制。排除标准：①既往心、脑、肝、肾等疾病者；②合并慢性高血压、糖尿病、血脂异常等者；③既往反复自然流产、死胎或死产史。根据是否伴FGR分为单纯GDM组和GDM+FGR组。另选同期健康分娩孕妇为对照组。本研究经本院伦理委员会审批,研究对象均自愿参并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1血清学指标取入组孕妇晨空腹静脉血,采用改良铜试剂比色法测定血清游离脂肪酸(FFA),试剂盒由南京建成科技有限公司生产；日立7600自动全生化分析仪酶法测定血清总磷脂(PL)水平,试剂盒由浙江东瓯生物工程有限公司生产。

1.2.2组织学标本处理各组孕妇均于剖宫产时或胎盘娩出后,立刻在无菌状态下于脐带根部采集胎盘组织4～6块,每块体积1.0cm×1.0cm×1.0cm,注意避开出血、钙化及梗死区。胎盘标本以无菌生理盐水冲洗数次,用无菌棉纱布吸干水分,其中2～3块置4℃ 2.5%戊二醛中固定,用于石蜡包埋和连续切片行电镜检查；另2～3块置经高温高压处理的EP管内,立即投入液氮冷却,置-80℃中统一待测mRNA。上述操作均在5min内完成。

1.2.3组织学检查①免疫组化检查：对戊二醛固定的胎盘标本进行切块,以4%戊二醛及1%锇酸双固定,然后按100%、95%、70%、50%乙醇梯度脱水各5min,以环氧树脂包埋后切片。超薄切片采用柠檬酸铅以及醋酸双氧铀双染色处理,电镜下观察并拍摄。②实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测： TRIzol法提取细胞总RNA(美国Invitrogen公司试剂盒)。逆转录合成cDNA(Maxima First Strand Synthesis Kit Thermo Scientific公司试剂盒),总体积为10μl,逆转录条件：42℃ 40min→85℃ 5min,短暂离心后迅速冰上冷却,置-20℃冰箱保存待用。Step One Real-Time PCR系统由Applied Biosystems公司提供,采用qRT-PCR技术检测,主要检测胎盘组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)、C/EBP 同源蛋白(CHOP)、B 淋巴细胞瘤-2 基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax) mRNA基因表达,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因,RT-PCR引物由上海生物工程股份有限公司设计合成,引物序列见表1。PCR反应条件：95℃预变性20s→95℃变性3s→60℃退火/延伸30s,共40个循环。采用相对定量法2-△△Ct进行结果统计,Ct值即每个PCR反应管中荧光信号达到预设阈值的循环数。

表1 基因引物序列扩增片段

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般临床资料

GDM组85例,年龄(29.1±4.0)岁(23～40岁),孕周(37.7±0.6)周(37～40周)； GDM+FGR组41例,年龄(29.3±4.1)岁(22～40岁),孕周(37.6±0.5)周(37～39周)。对照组50例,年龄(28.9±3.7)岁(22～40岁),孕周(38.2±0.8)周(37～42周)。3组年龄、分娩孕周无差异(P>0.05)。

2.2 各组血清FFA 、PL 水平比较

血清FFA、PL水平,GDM+FGR组最高、GDM组次之、对照组最低(P<0.05)。见表2。

2.3 各组胎盘滋养细胞内质网超微结构特征

镜下观察显示,对照组胎盘组织中滋养细胞内质网丰富且形态规整,未见肿胀、扩张等表现(图1A)(2137页)。GDM组(图1B)(2137页)和GDM+FGR组(图1C)(2137页)胎盘组织中滋养细胞内质网存在脱颗粒表现,伴有明显扩张甚至融合,且以GDM+FGR组融合较多见。

表2 各组血清FFA 、PL 水平比较

2.4 各组胎盘组织中蛋白表达水平

GDM组和GDM+FGR组胎盘组织中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表达水平,GDM+FGR组最高、GDM组次之、对照组最低(P<0.05)。见表3。

表3 各组胎盘组织中各蛋白表达比较

2.5 血清学指标与胎盘蛋白表达的相关性

Pearson线性相关性分析显示,对照组血清FFA、PL水平与胎盘GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表达无相关性(P>0.05),而GDM组和GDM+FGR组血清FFA、PL水平均与胎盘GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表达呈正相关性(P<0.05)。见表4。

表4 各组血清学指标与胎盘各蛋白表达的相关性

3 讨论

FGR潜在致病因素较多,常与孕妇GDM、HDCP、血液高凝状态等有关。既往研究多集中于HDCP合并FGR的研究,缺乏对GDM合并FGR的研究[7]。GDM往往因孕期血糖控制不良并发HDCP等,导致胎盘功能下降,合并FGR时可增加围产儿死亡风险,推测两种病症可能存在共同的病理生理基础[8]。

胎盘滋养细胞增殖、迁移在胚胎植入以及母-胎免疫耐受中具有关键性作用[9]。有研究表明,滋养细胞生物学行为可能与子痫前期或子痫、流产、GDM及FGR等有关,可能涉及氧化应激因子、血管生成因子等调节作用[10]。内质网在蛋白质翻译后的修饰、折叠以及寡聚化过程中具有重要作用,平衡受损可导致内质网应激反应激活,诱发多蛋白基因异常表达,引起细胞损伤甚至凋亡[11-12]。妊娠期妇女内质网在胎盘转运代谢功能的维持中具有重要作用。有研究表明,内质网应激反应与子痫前期、糖尿病、肥胖等密切相关,且在GDM孕妇中具有明显的内质网应激反应[13-14]。因此推测,由内质网应激所诱发的胎盘滋养细胞生物学行为异常可能影响了胎盘功能及胎儿发育,而胎盘发育障碍或功能降低先于FGR的发生[15]。有研究显示,GDM孕妇存在胎盘超微结构改变,且直接影响胎儿生长[16]。本研究显示,GDM孕妇胎盘组织中存在明显的内质网扩张、肿胀等病理改变,且在GDM+FGR组表现尤为明显。提示内质网应激可能与胎盘滋养细胞异常有关,而二者可能与GDM及FGR的发生有关。

在内质网应激状态下,激酶ASK1/JNK激活、Caspase-12活化以及CHOP/GADD153路径活化是引起细胞凋亡的主要途径[17]。CHOP是内质网应激反应中的特异性转录因子,在能量代谢及细胞增殖、分化、凋亡等过程中具有重要调节作用；当发生内质网应激反应下可大量生成,并可诱导Bax等系列下游凋亡分子激活,并下调Bal-2等抗凋亡基因表达,启动细胞凋亡途径,诱导细胞周期停止或细胞凋亡[18]。 Caspase-12是介导内质网应激反应途径中的关键蛋白。内质网应激反应下,钙离子平衡紊乱可导致Caspase-12被大量激活并移位至细胞质内,进而激活Caspase-3、Caspase-9等而触发细胞凋亡[19]。同时,激活的Caspase-12可诱导细胞色素C等因子释放,诱导下游促凋亡因子的激活而引起细胞凋亡[20]。本研究检测胎盘中GRP78、Caspase-12、CHOP及Bax mRNA表达显示,在GDM及GDM+FGR组中均呈明显高表达,且GDM+FGR组最高,与韩云等[21]报道基本一致。推测GDM孕妇的胎盘组织中存在内质网应激反应,且GDM合并FGR时细胞凋亡可能增多。

妊娠期体内激素分泌增加可影响脂代谢,以TG升高为主[22]。高TG血症可导致动脉粥样硬化发生。TG可分解成为甘油和FFA,FFA是体内脂肪的主要供能形式,在妊娠中晚期孕妇体内开始明显升高[23]。FFA过剩可产生“脂毒性”,主要通过诱导炎性因子分泌、线粒体功能损害、氧化应激损伤、内质网应激损伤等而诱导细胞凋亡[24]。因此,FAA水平是机体膜质代谢障碍、脂质损害的重要指标,也是引起细胞功能障碍的重要因素。PL在维持稳定细胞膜流动性及膜依赖性代谢中具有重要作用,同时也是胆汁的重要组成部分。为维护细胞膜结构的稳定性,体内PL代偿性升高,故PL异常升高也提示体内脂质代谢异常[25]。本研究中,GDM组和GDM+FGR组的血清FFA、PL水平均明显高于对照组,提示GDM孕妇存在脂肪酸代谢障碍及PL代偿性升高。研究显示,“脂毒性”的主要特征为脂质大量蓄积于非脂肪组织中,可引起内质网应激增加及细胞凋亡。业已证实,GDM孕妇血清FFA水平较正常妊娠孕妇明显升高[26]。FFA异常可引起细胞功能紊乱,加速血管内皮细胞合成TG,增加血管内皮细胞的过氧化反应引起细胞损伤,从而引起子宫胎盘缺氧、缺血最终导致FGR[27]。本研究中,GDM+FGR组的血清FFA及PL水平均高于GDM组,推测血清FFA及PL过表达可能加重了“脂毒性”及内质网应激反应,诱发血管内皮细胞损伤及子宫胎盘缺血,进而引起FGR的发生。相关性分析显示,GDM组和GDM+FGR组,血清FFA及PL水平均与胎盘中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA表达成正相关性,且以GDM+FGR组的相关性更强。提示孕妇机体脂质改变可能产生“脂毒性”而参与GDM的发生,且FFA及PL过表达可能与内质网应激增加及随后发生的胎盘滋养细胞生物学行为异常有关。

综上所述,GDM孕妇存在血清FFA、FL异常升高,可能参与了胎盘滋养细胞内质网应激,导致胎盘组织中GRP78、Caspase-12、CHOP、Bax mRNA过表达,引起细胞增殖、侵袭性迁移能力减弱而增加细胞凋亡；且合并FGR时“脂毒性”及内质网应激反应更强,加重了胎盘滋养细胞的异常。早期调节FFA、FL水平及内质网应激反应相关通道,纠正胎盘滋养细胞生物学行为异常,可能在改善GDM不良妊娠结局、防治FGR中有一定作用。