周熳琳，董珮玲，韩禹婷，陆弈橙，杨 琨,2,3

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030;2.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030;3.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

藏羊（Tibetan sheep）别称为藏系羊，是我国三大原始绵羊品种之一[1]。藏羊因其耐高寒，耐干旱而喜湿冷等习性而合适高寒牧区的生活，相比于其他品种更加适合低氧环境而成为西北牧民的主要饲养畜种。本实验依据藏羊的自身耐高寒和缺氧的特点开展研究。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），又称为血管通透因子（vascular permeability factor,VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，当前VEGF家族有7个，分别是VEGF-A、VEGFB、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及胎盘生长因子(placenta growth factor,PIGF)[2,3]。血管内皮生长因子在促进血管通透性的增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等方面具有重要作用。一般在正常机体内血管的形成和抑制是处于平衡状态，新生的血管受到严格的控制，大量的血管生成可出现于胚胎发生、损伤修复等时期[4]。VEGF的作用调控机制如下：作为一种强大的血管直接诱导因子，可诱导血管内皮细胞的增殖，通过细胞小囊泡器来实现增加血管通透性，使得血管成分泄漏，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供条件。这种特异性有丝分裂元，不仅在体内可以诱导血管的增生，还可以促进细胞的增殖。在低氧条件的处理下，VEGF蛋白可以与内皮细胞的VEGF受体结合，诱导受体的自身磷酸化，从而激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），实现VEGF的有丝分裂原特性，诱导内皮细胞的增生。而且有大量研究表明血管内皮生长因子不仅参与调控内皮细胞的增殖，对于非内皮细胞的增殖分化也有一定的影响，就比如说VEGF受低氧诱导因子的调控，在低氧条件下可以刺激血管平滑肌细胞不断增殖并大量分泌低氧诱导因子，而低氧诱导因子可以使VEGF的mRNA和蛋白以及VEGF受体的mRNA表达水平增高[5,6]。当Folkman提出“实体恶性肿瘤的生长和转移离不开新生血管”的观点之后，就有大量研究发现，在低氧环境的条件下，可以促进血管内皮生长因子在细胞间的过量表达，而过量表达与肿瘤血管的形成有密切的关系[7]。由于血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体2构成信号通路是作用最强的正性调控通路之一，对血管新生的整个过程的调节起到了无法替代的作用，这也就导致人们对于血管内皮生长因子的研究愈发向肿瘤方向靠拢[8]。

本实验欲通过免疫组织化学方法来初步分析VEGF在1岁藏羊脾脏中的表达分布以及探讨VEGF因子在藏羊适应高寒低氧环境的调控机制，为高原低氧研究提供形态学研究资料[4]。

1 材料与方法

1.1 材料的采集

本实验所采用的组织均为1岁健康藏羊的脾脏，所有的健康组织都在甘肃省兰州市某屠宰场采集。在藏羊放血后15 min内立即采集脾脏组织并用4%的多聚甲醛固定。

1.2 材料的处理

按照石蜡包埋的常规方法先将藏羊脾脏组织切成长宽均为1 cm左右，厚度不超过5 mm的小块进行包埋，再将包埋好的蜡块进行修块和切片（厚度一般为4～5 um），最后使用HE染色方法以及免疫组织化学染色技术对制成的切片进行染色处理。

1.3 实验所需试剂

本实验用到的试剂包括兔VEGF多克隆抗体（bs-1665R）、免疫组织化学检测试剂盒（SP-0023）以及AEC水溶性显色试剂盒，所需试剂均从北京博奥森生物技术有限公司买入。

1.4 HE染色及免疫组织化学方法检测

将制成的切片先进行HE染色观察藏羊脾脏的组织结构的完整性及其结构特点，然后采用免疫组织化学染色方法对切片进行检测，所有步骤根据HE染色常规方法和免疫组织化学检测试剂盒的说明书中的操作顺序进行。

1.5 实验结果的判定

本实验将经过AEC水溶性显色试剂盒染色的藏羊脾脏组织切片的染色结果进行对比，根据染色结果中脾脏组织的染色深浅以及染色面积来判定VEGF在藏羊脾脏组织中的表达强弱。

2 结果与分析

2.1 藏羊脾脏的组织学结构

观察图1（A,B）可知藏羊脾脏的结构组织完整，各个部位发育状况良好，没有发现病变部位。并且切片中可观察到藏羊脾脏的实质部分的组织分布明显，较易区分。其中白髓中的中央动脉容易辨认，有明显的分层，由里及外可分为内膜层、中膜层以及外膜层。血管内膜层衬于血管腔面组成内膜层，由平滑肌构成中膜层，结缔组织组成外膜层。

图1 藏羊脾脏组织切片HE染色法观察结果

2.2 免疫组织化学法检测藏羊脾脏中VEGF蛋白的表达

由免疫组织化学方法染色的结果图2（A,B）可见藏羊脾脏的白髓、红髓，被膜以及小梁等组织都有VEGF蛋白的表达。但仔细观察染色结果可发现VEGF呈强阳性表达于藏羊脾脏白髓的中央动脉内膜血管内皮细胞和外膜层的纤维细胞，红髓中脾血窦的内皮细胞；小梁和被膜上呈现弱阳性表达，而在中央动脉中膜层平滑肌中基本无表达。

图2 藏羊脾脏组织切片免疫组织化学检测结果

3 讨论

藏羊作为高原寒冷特殊的生态环境中典型动物代表，具有一定的高原低氧适应性[9,10]。脾脏是主要的外周免疫器官在免疫应答中起到了无法替代的作用，而脾脏功能的实现更是依赖于其特殊的血液微循环系统[11-13]。有研究表明VEGF对脾脏切除手术后自体移植脾脏组织再生血管的形成有促进作用，可以改善脾脏组织的血液循环，促使被移植脾脏组织的再生，可以有效缩短脾脏形态结构完善的时间以及促进脾脏发挥免疫作用等功能[14]。

VEGF作为特异性的有丝分裂元对新生血管的过程起着无法替代的调控作用，在正常氧浓度中起着维持血管平衡的作用且表达量较少，但因为低氧作用是影响VEGF表达的主要因素，在此条件下VEGF的表达会显著增加。实验结果中也可发现在藏羊脾脏的内皮细胞中有大量的表达，可验证在低氧环境会促进VEGF与内皮细胞上的特异性受体相结合，达到刺激内皮细胞增殖的目的。

有研究发现VEGF可在脾脏边缘区的淋巴细胞以及白髓的淋巴组织中检测，并且发现外源性的VEGF对自体移植的脾脏组织不仅对血管的再生有促进作用，还可以促进细胞的增生，结构的恢复以及局部形成良好的血供[15-17]。更有低氧对VEGF表达的促进作用都可以说明本实验的研究结果VEGF会表达于藏羊脾脏白髓中的各种淋巴细胞和中央动脉的血管内皮细胞以及外膜层，红髓中的血窦以及边缘区的淋巴组织。这说明VEGF在藏羊脾脏组织的形态结构和功能的维持中起着不可替代的作用。