高 豹 吕 恒 周东明 胡 丹 韩一芳 蔡旭燊 陆云军 卢一辰 张锦海** 熊晓辉 操 敏,**

(1. 南京工业大学食品与轻工学院; 江苏南京 211816；2. 东部战区疾病预防控制中心，江苏南京 210002)

恙虫病(tsutsugamushi disease)是由恙虫病东方体Orientiatsutsugamushi人群引起的自然疫源性疾病，在我国流行历史悠久。近年来随着砍伐森林、兴修水利、筑路、旅游、驻训等野外作业行为的增多，人群与自然疫源地的接触越来越密切，从而导致病例不断增多，恙虫病已成为我国不容忽视的公共卫生问题(Luetal., 2010; 操敏等，2011)。迄今为止，我国已有22个省区报道该病的流行。由于该病的临床症状与许多发热性疾病的临床症状相似，易引起误诊，因此，恙虫病的早期诊断尤为重要。

恙虫病东方体56 kDa是主要的外膜蛋白之一，已证实为良好的诊断抗原(Stoveretal., 1990)。我国恙虫病疫区分布广泛，不同疫区可能存在多种不同型别的东方体，且存在异型抗原抗体不发生结合反应或反应弱的现象(Kellyetal., 2009; Parketal., 2010)，因此制备多种型别的恙虫病东方体抗原，以多种抗原混合作为诊断抗原，有利于提高诊断方法的敏感性，扩大检测谱。本研究选用我国东方体新型分离株SJ2株(Caoetal., 2016)为靶抗原，克隆表达了该株56 kDa 截短蛋白基因片段。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，活性通过蛋白印迹法进行分析，为进一步建立诊断方法提供备选诊断抗原。

1 材料与方法

1.1 毒株

在L929细胞中传代保存的恙虫病东方体SJ2株，来源于安徽省三界地区黑线姬鼠体表临淮岗纤恙螨感染小白鼠获得的恙虫病东方体分离株。

1.2 试剂

引物由南京赛百胜生物公司合成；ExTaq、dNTP、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ均购自大连宝生物工程公司，DNA Marker和蛋白Marker购自Fermentas公司，PCR割胶回收试剂盒购自Promega公司，IPTG购自南京生兴生物公司，PCR试剂盒购自TAKARA公司，Ni-NTA Agarose、DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒购自QIAGEN公司，质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 DNA提取与目的片段PCR扩增

采用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒从感染恙虫病东方体SJ2株的L929细胞中提取DNA。引物序列：上游引物 5′-G G G G A T C C C T T A A T A G T G C A T C T G T C G AA-3′；下游引物：5′-C G C G A A T T C C T A GA A G T T A T A G C G T AC-3′引物由生工生物(上海)股份有限公司提供。以提取的恙虫病东方体DNA为模板，采用50 μL反应体系进行目的片段PCR扩增 ：10×Taq 0.5 μL，buffer 12.5 μL；上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，补加ddH2O至50 μL。采用以下步骤进行PCR循环：预变性：95°C 5 min，然后94℃ 40 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，共36个循环，最后72℃延伸10 min，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.4 序列测定及分析

扩增目的基因片段送至英俊公司测序。序列采用软件Bioedit与我国主要东方体流行株56 kDa蛋白进行氨基酸序列比对分析。

1.5 重组表达载体的构建和鉴定

PCR产物和pET-28a用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切，用Promega公司的PCR割胶回收试剂盒对目的DNA进行回收，定量后用T4 DNA连接酶进行连接，并转化感受态细胞DH5α，挑取卡那霉素LB固体培养基平板上的菌落，放入含有卡那霉素LB液体培养基中培养过夜，进行PCR验证，PCR 扩增条件同1.3。

1.6 重组蛋白在大肠杆菌中的表达

使用质粒小提试剂盒提取鉴定后的阳性克隆质粒，通过热激法将阳性质粒转化到感受态细胞BL21中。挑取单菌落于LB培养基内，37℃振荡培养过夜；将菌液按1∶100接种于含有卡那霉素的新鲜LB培养液中，37℃ 160 r/min振荡培养4 h后，加IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，37℃诱导培养4.5 h；取1.5 mL菌液离心后，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，置沸水浴中10 min。取制备好的样本10 μL进行 SDS-PAGE 电泳分析。

1.7 重组蛋白的纯化

大量诱导表达目标菌液，离心收集沉淀，用8 mol/L尿素裂解沉淀，离心取上清液过QIAGEN Ni-NTA Agarose，用5倍柱体积洗涤液清洗镍柱2～3次，最后用洗脱液洗脱镍柱上的蛋白。取10 μL纯化后样本进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.8 免疫印迹分析

将胶上蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，恒流120 mA转移90 min。封闭液选用5%的脱脂奶粉，室温封闭60 min。一抗选用3份病人血清混合为1份作为阳性血清，3份正常人血清混合为1份作为正常人对照血清，病人血清和正常人血清各一份按照1∶3000进行稀释，室温孵育2 h；二抗选用HRP标记的山羊抗人IgG按照1∶4000进行稀释，室温孵育2 h，最后加入染色剂避光反应5～10 min。

2 结果

2.1 目的片段的PCR鉴定

成功从样本DNA中扩增出约708 bp的特异性抗原基因(图1)。

图1 目的基因片段PCR扩增

2.2 基因测序及序列比对分析

将扩增的基因片段送至英俊公司测序，序列递交GenBank 获得序列号为KM115577.1。用Bioedit软件推导成氨基酸序列并进行序列比对分析(图2)。

图2 东方体SJ2株56 kDa截短蛋白(sj-short)与国内主要流行株序列比对图

2.3 重组表达质粒PCR鉴定及双酶切鉴定

将PCR产物与pET-28a连接，转入已制备好的DH5α感受态中。从转化平板上挑取单菌落，培养后提取质粒，进行PCR鉴定。凝胶电泳结果显示，在1～3号样品PCR鉴定泳道均出现一条大小约708 bp的特异条带，与预期大小一致。(图略)。进一步用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切验证。凝胶电泳结果显示(图3)，在鉴定泳道5.6 kb和708 bp处分别出现特异条带，与预期大小一致，表明成功地构建了重组表达质粒。

图3 重组表达质粒双酶切鉴定

2.4 重组蛋白的表达和纯化

对诱导表达的重组菌体进行SDS-PAGE分析，蛋白凝胶电泳图显示，在约为27 kDa处出现一条明显的表达条带，同预期的目标蛋白的大小一致，表明56 kDa蛋白基因在原核系统内得到了融合表达。收集从镍柱上洗脱的重组蛋白，每管取10 μL样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示重组蛋白获得单一的条带，条带大小约为27 kDa(图4)。

图4 重组蛋白的表达和纯化

2.5 重组蛋白的抗原性鉴定

恙虫病东方体56 kDa型特异性基因工程蛋白抗原经SDS-PAGE电泳转膜后，以恙虫病东方体感染的病人多抗血清为抗体(正常人血清为对照)进行 Western blot 反应，结果显示该多抗血清能够特异性识别恙虫病东方体56 kDa型特异性重组抗原蛋白(图5)。

图5 重组蛋白的抗原性鉴定

3 讨论

恙虫病是一种自然疫源性疾病，病原体是恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi，Ot)，通过恙螨幼虫叮咬传播。恙虫病诊疗重点在于及早明确诊断，临床上应用较为广泛的是免疫学诊断方法，需要进行抗原的制备。过去常用鸡胚培养、细胞培养等方式获得抗原，但操作步骤繁琐、培养周期长、产量低(操敏等，2003)。近年来随着分子生物学技术的发展，越来越多的重组抗原取代天然抗原作为诊断抗原，达到了经济、方便的目的。

恙虫病东方体56 kDa蛋白，包括4个保守区和4个可变区，保守区在同型抗体反应中起重要作用，而可变区在异型抗体反应中起作用(Ohashietal.,1992)，国内外多针对该抗原研制诊断抗原(Stoveretal., 1990; Caoetal., 2007)。我国存在恙虫病的不同疫区，存在多种不同东方体型别。安徽省三界地区是恙虫病的新疫区，2007年11月进驻三界的训练部队发生恙虫病暴发流行。恙虫病东方体SJ2株是本课题组前期在安徽三界地区黑线姬鼠体表临淮岗纤恙螨中首次分离到的，与韩国young-worl株亲缘性高(Caoetal., 2016)。本研究克隆表达了恙虫病东方体SJ2分离株56 kDa 截短蛋白约708 bp基因片段，包括2个保守区和1个可变区，推测可与同型及异型抗体均发生反应。重组蛋白可被恙虫病病人血清识别，与正常人血清不发生反应，表明重组蛋白具有良好的免疫反应活性，可作为诊断抗原,或与其他恙虫病东方体型别重组抗原混合，用于恙虫病诊断试剂的研制。