梁真真，徐海圣

(浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058)

中华鳖(Pelodiscussinensis)俗称甲鱼，是我国重要的淡水养殖品种。近年来，随着养殖规模的不断扩大，集约化程度不断提高，传染性疾病暴发对中华鳖养殖业造成了巨大的经济损失，严重威胁并制约中华鳖养殖业的健康发展[1]。目前主要采用化学药物防治疾病，而化学药物的不规范使用会带来较大的食品安全隐患，并危害生态环境。免疫防治作为一种更加安全环保的防控手段，逐渐成为研究热点[2]。白细胞介素-17(interleukin-17，IL17)是一种促炎细胞因子，由6种IL-17家族配体和5种受体组成[3]。IL17主要由Th17细胞分泌，参与细胞的增殖分化、生物因子的转录与表达、机体的免疫调节及肿瘤生长等，可诱导多种炎症相关的细胞因子、趋化因子及抗菌蛋白的产生，在机体的宿主防御中发挥重要作用，与多种自身免疫疾病和炎症疾病密切相关[4-5]。IL17在肿瘤研究中得到广泛关注，在前列腺癌[6]、乳腺癌[7]和胃癌[8]等多种人类肿瘤中均已检测到Th17细胞及其细胞因子IL17的表达。本研究构建了IL17原核表达载体pET28a-IL17，成功进行了融合蛋白的体外表达并制备多克隆抗体，为探讨IL17在中华鳖免疫调节中的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体

大肠埃希菌DH5α、大肠埃希菌BL21(DE3)、原核表达载体pET28a，均购自浙江易思得生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma公司；Ni-NTA柱， Invitrogen公司；NC膜，密理博(中国)有限公司；酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；预染低分子量蛋白Marker，BIO-RAD公司；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG，Abcam公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒，浙江易思得生物科技有限公司。

1.1.3 实验动物

健康新西兰大白兔，体重2.5 kg，由浙江大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 重组蛋白表达载体的构建

通过NCBI查到中华鳖IL17基因序列的GenBank号为XM_006137045.2，将IL17蛋白基因序列进行大肠埃希菌密码子偏好性优化，并在其5′端和3′端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，优化设计完成后委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因合成，合成的片段克隆至pET28a载体，即pET28a-IL17载体。将阳性质粒pET28a-IL17送至杭州尚亚公司进行测序，并保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达

将测序正确的重组质粒pET28a-IL17转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆于1 mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1培养菌液至浑浊时，再扩大培养，待D值等于0.6时加1 mmol·L-1诱导剂IPTG，继续培养，最终培养时间为3 h，每隔1 h 取样10 μL，进行12% SDS-PAGE分析。

1.2.3 重组蛋白的纯化

在菌液沉淀中加入5 mL PBS缓冲液重悬，并加入0.1 mmol·mL-1蛋白酶抑制剂PMSF，冰浴条件下超声破碎，12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用8 mol·L-1尿素缓冲液溶解沉淀后，12 000 r·min-1离心10 min，留上清，按照 Ni-NTA柱操作手册进行蛋白纯化，用SDS-PAGE蛋白胶检测蛋白的纯化情况。

1.2.4 多克隆抗体制备

取重组IL17蛋白1 mg，与等体积佐剂充分混合，每隔2周采用皮下注射的方式对2只新西兰大白兔进行免疫，共免疫4次。第1次免疫时使用完全弗氏佐剂，其他3次使用不完全弗氏佐剂。第4次免疫2周后，心脏采血，5 000 r·min-1离心20 min后取上清，使用Protein A/G进行血清的纯化。

1.2.5 Western blot分析

将纯化好的IL17蛋白经12% SDS-PAGE分离，将蛋白条带转至NC膜上，用1% BSA溶液4 ℃过夜封闭，加入1%BSA 1∶5 000稀释的IL17蛋白多克隆抗体，室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，加入HRP标记的抗兔IgG二抗(1% BSA 1∶2 000稀释)，室温孵育2 h，经PBST洗涤3次，显色。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的鉴定

将合成的重组表达质粒pET28a-IL17进行测序，测序结果与密码子优化后的序列比对一致，表明重组质粒构建正确，优化前后的序列相似性为74.6%(图1)。

图1 IL17基因序列优化前后比对

2.2 体外表达产物的鉴定

如图2所示，诱导表达1、2、3 h后，在约20 ku处有1条与预期大小相符的特异蛋白带，说明IL17蛋白在BL21(DE3)表达菌中成功表达。

2.3 纯化产物的鉴定

通过Ni-NTA柱对样品进行亲和层析纯化，可获得纯度较高的重组IL17蛋白(图3)。

2.4 IL17多克隆抗体检测

用纯化蛋白免疫新西兰白兔后，取血清，对抗体进行纯化后，用抗体稀释液与过表达IL17蛋白进行Western blot分析。结果显示，制备的多克隆抗体与纯化蛋白可发生特异性反应(图4)。

1—蛋白质相对分子质量标准；2—诱导前；3—诱导后1 h；4—诱导后2 h；5—诱导后3 h。图2 重组IL17蛋白的SDS-PAGE鉴定

1—过柱后流穿液；2—6第1次到第5次洗脱样品；7—蛋白质相对分子质量标准。图3 亲和纯化IL17蛋白样品的SDS-PAGE鉴定

图4 IL17多克隆抗体对IL17蛋白的 Western blot鉴定

3 讨论

本研究成功构建了pET-28a-IL17重组表达质粒，并转入BL21(DE3)表达菌进行IL17蛋白的体外诱导表达，表达的目的蛋白大小与预期相符，表明优化后的表达载体能够成功表达目的蛋白。虽然中华鳖的IL17蛋白序列已经存在，但是国内外并未有报道中华鳖IL17蛋白的生物学特性及免疫调节作用。本试验利用体外表达技术，制备了中华鳖IL17蛋白的抗体，对IL17蛋白的作用研究有重要意义。

IL17的研究已经向应用研究的方向发展。白介素-17(IL17)是由Th17细胞分泌的参与中性粒细胞增殖、成熟和趋化、增强局部炎症反应的炎性因子，与其受体结合后可诱导白介素-6、肿瘤坏死因子TNF-α、转化生长因子TGF-β等促炎症因子的表达，造成局部炎症，在肝癌、直肠癌及卵巢癌等多种肿瘤中发挥关键作用[9]。Punt等[10]研究发现，IL17主要在中性粒细胞中表达，能促进肿瘤生长。Carvalho等[11]研究发现，IL17高表达的甲状腺癌患者其复发转移率高。对于中华鳖来说，免疫防病及其机理方面的研究才刚起步，全面了解中华鳖IL17蛋白的生物学功能及其在免疫反应中的特点，并作为免疫增强剂在抵抗疾病中的应用研究具有重意义。