陈柯帆,陆运鑫,莫苑君,卢旭全,谭智威,侯恩存

(广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科2区,南宁 530012;*通讯作者,E-mail:yunxinlu99@163.com)

胰腺癌是目前恶性程度最高、预后最差的消化系统恶性肿瘤,且胰腺癌早期无特异性症状,约90%的患者确诊时已处于中晚期,且多伴发远处或局部转移[1]。胰腺癌的发病与发展是一个隐匿、缓慢且持续的过程,涉及多种因素协同作用,研究与胰腺癌发生、发展有关的蛋白和基因对明确胰腺癌的分子机制意义重大,并且对早期诊断、干预和治疗靶点具有切实的临床意义[2,3]。正性调节区锌指蛋白14(PRDM14)是人类肿瘤形成转录调节因子家族中的一员,与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关[4]。目前,PRDM14已被证明与乳腺癌[5]、肺癌[6]等多种恶性肿瘤的浸润、侵袭密切相关,在多种恶性肿瘤转移侵袭中发挥正向调控作用[7]。本研究旨在探讨PRDM14在胰腺癌中的表达和对肿瘤干细胞生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器

胰腺癌细胞株SW1990(ATCC细胞库,美国)。10%胎牛血清(Abcam公司,英国),EDTA抗原修复液(Abcam公司,英国),山羊封闭血清(Abcam公司,英国),PRDM14抗体(Abcam公司,英国),DAPI染色液(Abcam公司,英国)。全景扫描显微镜VS120和图像分析软件(奥林巴斯(中国)有限公司)。

1.2 实验动物

6-7周龄SPF级雄性小鼠裸鼠50只，体质量18-22 g,平均(20.64±1.14)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证：SCXK(京)2019-0006)，自由饮水及进食，洁净无菌环境下(温度22-25 ℃、湿度40%-50%)适应性饲养3 d。按照随机数字表法分为胰腺癌Ⅰ组、胰腺癌Ⅱ组、胰腺癌Ⅲ组、胰腺炎组和对照组，各10只，根据研究设计分别对各组小鼠进行建模。

1.3 人胰腺癌细胞SW1990原位植瘤模型建立

胰腺癌Ⅰ组：建立人胰腺癌细胞SW1990原位植瘤模型:胰腺癌细胞常规培养后制备细胞悬液(3×106个),10%的水合氯醛25 μl/10 g进行腹腔注射,麻醉完成后常规腹部消毒,取小鼠腹中偏左侧剪开皮肤,打开腹腔找到脾脏,用生理盐水棉签将脾脏和胰腺轻轻向外翻出,采用300 U胰岛素注射器将约0.1 ml胰腺癌细胞悬液注射于胰腺体尾部,以胰腺体尾部实质鼓泡且无明显外渗为注射成功标志。注射完成后生理盐水棉签轻压注射点30-60 s,将脾脏及胰腺复位,采用3-0无菌缝合线间断缝合逐层关闭腹腔和皮肤,常规饲养,定期称重和检查胰腺肿瘤生长状态。

胰腺癌Ⅱ组：建立PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990原位植瘤模型,采用预先PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990制备细胞悬液(3×106个)建立小鼠胰腺原位植瘤模型。操作步骤同胰腺癌Ⅰ组。

胰腺癌Ⅲ组：建立control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990原位植瘤模型,采用预先control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990制备细胞悬液(3×106个)，建立小鼠胰腺原位植瘤模型。操作步骤同胰腺癌Ⅰ组。

1.4 急性胰腺炎小鼠模型建立

胰腺炎组采用腹腔注射雨蛙素和脂多糖建立急性胰腺炎模型,雨蛙素50 μg/kg腹腔注射10次,最后一次联合脂多糖10 mg/kg注射,注射点选小鼠腹中偏左约脾门位置。对照组小鼠腹腔注射生理盐水。

1.5 免疫组化检测胰腺组织PRDM14表达

所有小鼠常规饲养8周后处死并解剖,胰腺标本一分为二,一部分经石蜡包埋,行SP免疫组化染色[8],以PBS代替一抗作为空白对照,用已知的阳性标本作为阳性对照。结果由2名病理科医师进行双盲阅片并判定,阳性判定:细胞显色为深棕色或棕黄色[9]。结果判定:随机取5个高倍视野,分别计数100个细胞,通过染色强度和阳性细胞百分比联合进行判定,染色强度评分:0分代表不显色,1分为染色呈淡黄色,2分为染色呈中黄色,3分为染色呈深棕色;阳性细胞百分比:<10%为0分,10%-25%为1分,26%-50%为2分,>50%为3分,染色强度和阳性细胞百分比为总分,总分≥3分为PRDM14阳性,<3分表示阴性[10]。

1.6 Western blot法检测胰腺肿瘤组织PRDM14表达

所有小鼠常规饲养8周,胰腺标本。采用Wes-tern blot法检测小鼠胰腺肿瘤组织PRDM14表达,方法:聚丙烯酰胺凝胶配制—上样—凝胶电泳—转膜—牛奶封闭—一抗孵育—二抗孵育—显影成像。

1.7 划痕实验检测胰腺癌肿瘤干细胞迁移能力

采用培养箱中培养状态良好的人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅰ组)、PRDM14-sh RNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅱ组)和control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅲ组)，采用划痕实验观察三组细胞的迁移能力。具体方法：使用6孔细胞培养板分别接种稳定转染的人胰腺癌细胞株SW1990、PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990和control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990，轻轻摇动培养板使细胞均匀悬浮孔中。隔日换液，显微镜定时观察，待细胞融合度约90%，用10 μl移液器枪头在所有培养孔上划一条直线，注意要用力均匀，培养液吸除之后，用PBS冲洗各孔。加入2%血清培养基，将划痕、换液后的6孔板置于显微镜下观察划痕、拍照。继续培养2 d，显微镜下观察、拍照。

1.8 统计学分析

采用SPSS223.0进行统计学数据分析,计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素分析，两两比较采用LSD检验，计数资料采用率或百分比表示,采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠胰腺组织PRDM14的表达

胰腺癌造模组小鼠术后胰腺癌Ⅰ组死亡2只，胰腺癌Ⅱ组和胰腺癌Ⅲ组各死亡1只，对照组及胰腺炎组小鼠无死亡。免疫组化染色结果显示，胰腺癌组小鼠PRDM14阳性表达率明显高于对照组；胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组小鼠PRDM14阳性表达率明显高于胰腺炎组小鼠，胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组PRDM14阳性表达率明显高于胰腺癌Ⅱ组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，见表1和图1)。

表1 各组小鼠胰腺组织PRDM14免疫组化阳性表达例(%)

Table 1 Positive immunohistochemical expression of PRDM14 in pancreatic tissue of mice in each groupcases(%)

组别n 阳性 阴性对照组100(0.00)10(100.00)胰腺炎组101(10.00) 9(90.00)胰腺癌Ⅰ组87(87.50)∗# 1(12.50)胰腺癌Ⅱ组93(33.33)∗ 6(66.67)胰腺癌Ⅲ组98(88.89)∗# 1(11.11)

与对照组比较,*P<0.05;与胰腺炎组比较,#P<0.05

A.对照组；B.胰腺炎组；C.胰腺癌Ⅰ组;D.胰腺癌Ⅱ组;E.胰腺癌Ⅲ组图1 不同胰腺组织PRDM14阳性表达 (免疫组化,×20)Figure 1 Immunohistochemical PRDM14 positive expression images of different pancreatic tissues (×20)

2.2 胰腺癌各组小鼠胰腺肿瘤组织PRDM14表达差异

结果显示，胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组PRDM14表达量明显高于胰腺癌Ⅱ组，组间差异有统计学意义(P<0.05，见图2,3)。

与胰腺癌Ⅱ组比较，*P<0.05图2 各组胰腺癌小鼠胰腺肿瘤组织PRDM14表达差异Figure 2 Differential expression of PRDM14 in pancreatic tumor tissues of pancreatic cancer mice in each group

图3 各组胰腺癌小鼠胰腺肿瘤组织PRDM14电泳图Figure 3 PRDM14 expression of pancreatic tumor tissues in each group by electrophoresis

2.3 PRDM14对胰腺癌肿瘤干细胞迁移能力的影响

结果显示，胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组肿瘤干细胞迁移能力明显高于胰腺癌Ⅱ组(见图4)。

图4 三组胰腺癌肿瘤干细胞迁移能力划痕实验Figure 4 Scratch test results of migration ability of pancreatic cancer tumor stem cells in three groups

3 讨论

正性调节区锌指蛋白14(PRDM14)所在的PRDM家族是关于人类肿瘤形成的转录调节因子家族,共17个(PRDM1-17)成员[11]。其中PRDM14现已被证实与多种细胞的增殖、分化有关,与多种癌症的发生发展密切相关[12]。Nishikawa等[13]研究显示,PRDM14可以作为判定乳腺癌临床治疗预后的参考指标;Taniguchi等[5]研究表明,可通过沉默PRDM14抑制乳腺癌的发生和转移。PRDM14在肺鳞癌和腺癌中高表达,在癌旁组织中低表达,且与分化程度密切相关[9]。

基于以上研究有理由推断,PRDM14在乳腺癌及肺癌中可能具有致癌作用,并且对肿瘤细胞的侵袭和预后相关。国外学者在研究中发现,在人乳头瘤病毒(HPV)诱导的子宫颈癌和癌前病变中PRDM14基因启动子甲基化十分常见,且对HPV感染阳性的癌细胞具有不同程度的抑制作用[14]。可见PRDM14在不同类型的恶性肿瘤中表达及作用存在差异,有待于进一步研究探讨。目前,PRDM14与胰腺癌相关研究甚少,PRDM14在胰腺癌中的表达以及对肿瘤细胞的作用尚未明了。Moriya等[15]通过胰腺癌小鼠模型试验表示,抑制PRDM14表达可降低胰腺癌小鼠肝转移,该学者在研究中发现,胰腺组织炎症可升高PRDM14表达水平,对介导肿瘤的发生可能具有重要的作用[16]。

本研究结果显示,在正常胰腺组织、胰腺炎组织以及胰腺癌组织中PRDM14阳性表达率呈明显上升趋势,未被处理的胰腺癌以及control病毒干扰的胰腺癌小鼠肿瘤组织PRDM14蛋白表达量明显高于PRDM14-shRNA慢病毒干扰的胰腺癌小鼠,结果提示,PRDM14在胰腺癌肿瘤组织中呈高表达,且与胰腺癌的发生具有密切关系。划痕实验结果显示,未被处理的人胰腺癌细胞株SW1990以及control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990划痕后培养48 h肿瘤细胞迁移数量明显高于PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990,结果进一步提示,PRDM14的高表达参与胰腺癌肿瘤干细胞的侵袭和转移。考虑可能因为PRDM14除具有PR结构域外,还包括其他锌指蛋白结构,多与具有组蛋白甲基转移酶(HMT)活性的蛋白质存在高度同源的SET结构域,使其具有组蛋白甲基转移酶活性,通过此作用调控了相关转录因子和肿瘤蛋白的表达,参与DNA转录,介导相关通路参与了肿瘤细胞的增殖和凋亡的调控过程[17]。基于以上研究笔者认为,PRDM14在胰腺癌组织中高表达,且与肿瘤组织的侵袭和转移有关,有望成为胰腺癌分子治疗的新靶点,具有重要的临床研究价值。

综上所述,PRDM14在胰腺癌组织中呈高表达,可能与胰腺癌的发生、侵袭和转移存在紧密关系,值得进一步研究探讨。