郭林芝,王晓晖,岳 丹,杜圣家,李灵敏*

(1山西医科大学基础医学院形态学实验室,太原 030001;2山西医科大学基础医学院病理学教研室;*通讯作者,E-mail:13835125305@163.com)

脂肪组织是机体重要的能量仓库,其广泛存在于全身的皮下及内脏各处。在哺乳动物体内,脂肪组织包括白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)。近年来,人们越来越重视对脂肪组织的研究,如研究白色脂肪棕色化的机制、探究降糖药物使体重减轻的原理等[1,2],许多研究都需要以良好的脂肪组织石蜡切片为基础。无论是白色脂肪还是棕色脂肪细胞内都含有脂滴,而脂滴的主要成分为三酰甘油酯,由于其成分的特殊性,采用常规组织的脱水流程恐难达到良好的制片效果。为了制出满意的脂肪组织石蜡切片,本实验用两种脱水流程比较白色脂肪组织和棕色脂肪组织石蜡切片制作效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄雄性BALB/c小鼠8只,清洁级,体质量22-25 g,购自山西医科大学实验动物中心[SCXK(晋)2015-0001]。

1.2 主要试剂及仪器

苏木素染液、伊红染液购自珠海贝索公司;饱和油红O染色液购自索莱宝生物科技有限公司;Rabbit Anti-GLP-1R antibody购自北京博奥森生物技术有限公司;山羊抗兔IgG/HRP聚合物,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Leica TP1020自动脱水机;Leica RM2245型半自动旋转式切片机;Leica CM1950冰冻切片机。

1.3 脂肪组织采集及处理流程

颈椎脱臼法处死小鼠6只,每只鼠分别取双侧睾丸脂肪垫的白色脂肪组织标本2块和双侧肩胛间区的棕色脂肪组织标本2块,大小为(0.5-1.5)cm×(0.5-1.5)cm×(0.2-0.3)cm,将每只鼠的两种脂肪组织均随机等分为对照组和实验组。所有标本均用10%的中性甲醛浸泡固定24 h。其中,对照组标本采用常规组织脱水程序进行,实验组标本采用延长脱水程序进行(见表1)。后续透明及浸蜡过程两组均按常规时间进行。处理后的脂肪组织标本用Leica石蜡包埋机包埋。

表1 组织脱水程序比较

Table 1 Comparison of tissue dehydration procedures

组别70%乙醇80%乙醇90%乙醇95%乙醇95%乙醇Ⅱ100%乙醇100%乙醇Ⅱ对照组2h2h1h1h1h30min30min实验组4h3h2h2h2h1h1h

1.4 切片、展片及烤片

制作好的石蜡块用Leica RM2245型半自动旋转式切片机进行切片，切片厚度4 μm。在水温42 ℃进行展片，60 ℃烤片30 min-1 h。

1.5 HE染色及免疫组化染色

脂肪组织HE染色按常规组织HE染色流程进行。免疫组化:切片常规脱蜡至水,3%H2O2室温孵育10 min,枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)高压修复2 min,晾至室温,10%BSA室温封闭20 min,滴加GLP-1R抗体(1 ∶200),4 ℃冰箱过夜。滴加二抗37 ℃ 40 min,DAB显色,苏木精复染,常规脱水、透明、封片,阳性表达部位在细胞膜。

1.6 两种脂肪组织油红O染色

颈椎脱臼法处死2只实验小鼠,取两种脂肪组织按照文献置于10%中性甲醛内固定24 h,擦干水分后冻于-80 ℃冰箱30 min,OCT包埋后置冰冻切片机切片,厚度为10 μm[3]。油红O染色:冰冻切片蒸馏水洗涤;60%异丙醇浸洗;油红O染色10 min;60%异丙醇分化至间质清楚;苏木素复染;甘油明胶封片。

2 结果

2.1 白色脂肪组织的两种脱水流程HE染色结果

延长程序组脂肪组织经HE染色,镜下观,脂肪组织无裂缝,细胞排列紧密,形态饱满,呈多边形空泡状,胞核呈扁平,清晰可见,胞膜无明显断裂、松散(见图1A、B)。

常规程序组脂肪组织HE染色,镜下可见脂肪组织形态基本完整,局部可见裂缝,细胞排列紧密,但形态欠饱满,胞核扁圆形,清晰可见,部分细胞膜有断裂,松散(见图1C、D)。

A.延长程序(×100);B.延长程序(×400);C.常规程序(×100);D.常规程序(×400)图1 白色脂肪组织HE染色Figure 1 HE staining of white adipose tissue

2.2 棕色脂肪组织的两种脱水流程HE染色结果

两种程序处理的棕色脂肪组织经HE染色,镜下可见脂肪组织形态完整、无裂缝,细胞排列紧密,脂肪细胞内可见许多小空泡,细胞周围血管清晰可辨,两种程序HE染色无明显差异(见图2)。

A.延长程序(×100);B.延长程序(×400);C.常规程序(×100);D.常规程序(×400)图2 棕色脂肪组织HE染色Figure 2 HE staining of brown adipose tissue

2.3 两种脂肪组织石蜡切片免疫组化染色

在石蜡切片HE染色的基础上,我们分别选取白色脂肪组织延长程序和棕色脂肪组织常规程序进行免疫组化染色。结果显示,两种脂肪组织在免疫组化染色过程中均未见明显脱片,镜下可见白色脂肪组织(见图3A)和棕色脂肪组织(见图3B)结构完整,细胞形态饱满,胞膜完整,阳性表达明显,背景清晰。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)图3 脂肪组织GLP-1免疫组化染色Figure 3 GLP-1 immunohistochemical staining of adipose tissue

2.4 两种脂肪组织冰冻切片油红O染色

两种脂肪组织油红O染色结果显示,白色脂肪组织细胞内可见较大的单个红染的脂滴(见图4A),而棕色脂肪组织细胞内可见多个大小不等的红染脂滴(见图4B)。

3 讨论

脂肪组织主要由不同性质的脂肪细胞组成,按照脂肪细胞的种类及功能的不同,将其分为白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)[4]。WAT的功能主要是将机体中过剩的能量以中性脂肪的形式贮存,以供机体需求时利用[5]。此外,WAT还可作为热绝缘体,有助于维持体温平衡[6]。BAT由于血管丰富呈棕色,主要维持机体体温和调控能量平衡[7]。两种脂肪细胞功能的不同主要源于其细胞组成不同。白色脂肪细胞内含有一个较大的脂滴,几乎占据了整个细胞(见图4A),线粒体含量却很少;而棕色脂肪细胞内虽然也含有脂滴,但是脂滴较小(见图4B),且多嵴线粒体和胞质含量丰富[8]。虽然都是脂肪组织,但由于两种脂肪细胞结构的差异,导致组织处理的脱水流程也会有差异。

A.白色脂肪(×400) B.棕色脂肪(×400)图4 脂肪组织油红O染色Figure 4 Oil red O staining of adipose tissue

白色脂肪的脂滴大且含量多,若按照常规脱水流程进行,会出现脱水、脱脂不彻底,石蜡不能完全进入到组织细胞内起到支撑作用,组织便会塌陷,难以切出完整切片。乙醇是实验室常用的脱水、脱脂试剂,乙醇分子中的极性基团羟基(-OH)可以与组织细胞内的水形成氢键将水置换出来从而起到脱水作用;而乙醇又可以与脂滴中的三酰甘油酯发生醇解反应从而起到脱脂作用。所以,必须延长白色脂肪在乙醇脱水、脱脂的时间。本实验结果证实,延长程序处理的白色脂肪,HE染色脂肪组织结构完整无裂缝,脂肪细胞形态饱满,细胞膜无明显断裂,免疫组化阳性结果明显,背景清晰,结果明显优于常规程序。相对于白色脂肪,棕色脂肪细胞内脂滴小而少,且细胞表面遍布神经及血管[9],对细胞起到了良好的支撑作用。所以,按照常规组织的脱水流程就可以完成脱水、脱脂。实验结果显示,无论是常规组织流程还是延长流程制作的石蜡切片,HE染色均可见棕色脂肪结构完整,细胞饱满,周围血管清晰,免疫组化阳性结果明显,背景清晰。本实验不足之处在于做油红O染色的小鼠与HE染色及免疫组化的小鼠不是采自同一小鼠的标本,主要由于小鼠棕色脂肪组织标本较小,再切取一部分做冰冻会导致冰冻组织太小,影响制片及染色效果。

综上所述,制作白色脂肪石蜡切片,应采用延长脱水程序,保证脱水、脱脂彻底;棕色脂肪,则按照常规组织制片程序制作石蜡切片,从而提高制片速度,提高科研效率。